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《第二军医大学》 2011年
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淋巴液引流技术改进及脓毒症大鼠淋巴液的代谢组学研究

李岩  
【摘要】:研究背景:脓毒症是重症监护病房中患者的首要致死原因,是危重病急救医学研究的重点和难点,其发病机制非常复杂。最近的研究表明,肠道淋巴管作为主要的非细菌性的肠源组织损伤因子的通路,可引发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(MODS)。尤其是MODS肠道淋巴液假说的提出更突显了淋巴液在炎症反应中的作用。因此,对淋巴液在脓毒症中的作用进行研究有助于更深入认识脓毒症的发病机制,为脓毒症的诊断和治疗提供新的思路。 第一部分:建立大鼠胸导管淋巴液引流及脓毒症盲肠结扎穿孔模型 目的:为了便于研究淋巴液在脓毒症和MODS中的作用,建立理想的淋巴液引流动物模型对研究具有重要的意义。 方法:20只SD雄性大鼠用10%水合氯醛,按0.35mL/100g对大鼠进行腹腔内注射麻醉。经左侧腹膜后寻找腹主动脉,沿腹主动脉左侧寻找淡乳白色的胸导管,钝性分离后放置预先弯成“U”型的聚乙烯导管PE50引流管,双重结扎并将导管固定在后腹壁上防止导管滑脱。将导管穿出背部皮肤连接真空采血管并固定在大鼠背部。每2小时收集一次样本,连续观察12小时。对引流的淋巴液样本进行计量、蛋白定量和淋巴细胞计数检测。另外将60只SD雄性大鼠按照盲肠结扎比例(25%、50%和75%)随机分成三组,每组20只。按上述麻醉方法麻醉后,用1-0丝线结扎盲肠,并用22#针头对穿盲肠一次,连续观察8天。留取脓毒症大鼠的肝、肺和小肠组织,常规制备病理组织切片,观察肝、肺和小肠组织的形态学变化。应用鲎试剂动态浊度定量测定法测定大鼠淋巴液中内毒素(LPS)水平并用ELISA法检测大鼠淋巴液中IL-1β、IL-6以及TNF-α的水平。 结果:胸导管淋巴液引流模型的成功率为95%,平均手术时间为35-40分钟/只。放置胸导管引流后12小时内淋巴液引流量平均为0.71±0.33 ml/h;淋巴液中蛋白质的浓度没有随着引流时间的增加而明显的下降,平均为37.14±2.59 mg/ml;淋巴细胞的数量却有很大的波动,范围在0.08×106-12.17×106个/ml之间。在穿刺针头一定的情况下,随着盲肠结扎长度的增加,脓毒症大鼠生存时间与生存率均显著下降(p0.01)。盲肠结扎的长度在25%,50%和75%组可以观察到其中位数生存时间分别为8天,4.5天和2.2天。形态学观察可见脓毒症大鼠的肝细胞排列紊乱,中央静脉和肝窦淤张,有肝细胞坏死和渗出;肺组织结构被破坏,基膜增厚,肺泡内充满了渗出的液体,部分肺泡内还有血性的渗出;小肠绒毛水肿,大量淋巴细胞浸润在粘膜下层和肌层,Peyers淋巴结明显增大。检测结果LPS对照组为0.76±0.41(pg/ml)、脓毒症组为13.56±5.04(pg/ml);IL-1β对照组为90.48±28.5(pg/ml)、脓毒症组为627.92±98.96(pg/ml);IL-6对照组为87.51±34.86(pg/ml)、脓毒症组为1353.67±209.4(pg/ml); TNF-α对照组为51.46±21.88(pg/ml)、脓毒症组为401.26±72.08(pg/ml)。各种指标在脓毒症组均明显上升,两组间差异有显著性(p0.05)。 结论:本研究中采用了自行设计了一套独创的淋巴液收集系统。采用这套系统可以允许大鼠在清醒、自由进食进水的情况下连续收集淋巴液样本,最大程度减少了对大鼠生理状态的干扰。在结扎盲肠比例在50%的情况下,脓毒症大鼠的炎症反应情况和死亡率能够满足本课题的需要,因此在以后的实验中均采用该方法了造大鼠的脓毒症模型。脓毒症大鼠的肝、肺和小肠组织有明显的形态学改变,淋巴液中的炎症因子也较正常对照组明显升高。 第二部分:脓毒症大鼠淋巴液诱导血管内皮细胞损伤的研究 目的:本研究采用脓毒症大鼠胸导管淋巴液诱导人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vascularendothelial cells,HUVEC)损伤,通过对内皮细胞损伤的研究为脓毒症的发病机制研究奠定基础。 方法:1)首先扩增HUVEC,将HUVEC与淋巴液共同孵育。应用MTT比色法检测脓毒症大鼠淋巴液不同浓度(2%、4%、6%、8%、10%)对HUVEC的抑制率,接下来再检测脓毒症大鼠淋巴液不同作用时间(2h、4h、6h、8h)对HUVEC的抑制率。2)用流式细胞仪检测脓毒症大鼠淋巴液作用后的HUVEC细胞的损伤情况。3)将淋巴液作用后的HUVEC爬片固定、HE染色、观察内皮细胞的形态学改变。4)电镜检测淋巴液作用后的HUVEC,观察其微观结构改变。 结果:1)在相同的作用时间下随着淋巴液浓度的增加, HUVEC的生存率也显著的下降,两组间差异有显著性(p0.05)。在相同浓度的情况下随着淋巴液作用时间的增加, HUVEC的生存率也显著的下降,两组间差异有显著性(p0.05),我们选定5%浓度作为本研究的淋巴液终浓度2)流式细胞仪检测表明在正常大鼠淋巴液和脓毒症大鼠淋巴液处理后的HUVEC中凋亡的细胞几乎没有,所检测的细胞均为annexin V阴性。但是在处理后的HUVEC中发现大量的死亡细胞(约占细胞总数的22.14%),这些细胞均为PI阳性细胞,两组间差异有显著性(p0.05)。3)通过对HUVEC进行HE染色发现对照组的HUVEC形态没有发生改变,细胞膜和细胞核结构没有异常。但是在脓毒症大鼠处理组却发现HUVEC的细胞数量明显下降,细胞密度降低,细胞核的染色加深,细胞膜的结构破坏,部分细胞核结构尚存在,没有发现凋亡特异性的凋亡小体存在。电镜检测结果发现在正常对照组HUVEC形态基本正常,而在脓毒症组可见内皮细胞受损的情况(包括坏死),仅发现极少数细胞出现了凋亡的征象。 结论:脓毒症大鼠胸导管淋巴液在不同浓度和作用时间情况下对HUVEC生存率的影响有显著性差异,随着淋巴液浓度的增加和作用时间的延长HUVEC的生存率明显降低。流式细胞仪和HE染色检测发现脓毒症大鼠作用后的HUVEC中有大量的死亡细胞,没有检测到典型的凋亡细胞。HUVEC死亡的主要原因可能与淋巴液中高浓度的LPS和炎症因子(IL-1β、IL-6以及TNF-α)有关。 第三部分:脓毒症大鼠淋巴液的代谢组学研究 目的:应用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法对大鼠淋巴液样本进行研究。通过对淋巴液中脂类代谢物质的检测,对比正常大鼠淋巴液与脓毒症大鼠淋巴液,寻找潜在的脓毒症生物标志物,为临床上对脓毒症的早期诊断和治疗提供依据,也为进一步了解淋巴系统在炎症中的作用机制提供依据。 方法:15只成年SD雄性大鼠按照第一部分的方法收集第1小时的淋巴液作为正常对照组,之后采用CLP方法造脓毒症模型,继续收集淋巴液样本,将第6小时收集的样本作为脓毒症组。样本离心后用乙腈抽提淋巴液中的脂溶性成分作为待测样本,过滤后在Agilent-1100型高效液相色谱分析仪上进行分析。获得HPLC/MS谱后对其进行数据处理和多元统计分析。 结果:基于HPLC/MS谱图信息,主成分分析法(PCA)可完全区分两组大鼠的生理特征。两组样本分布在不同的两个区域,可以直观的从图中判断两组的样本存在差异性。根据脓毒症大鼠胸导管淋巴液PCA分析的结果,选择了变化最明显的前30个物质,最终鉴定出了10个潜在生物标志物。其中在脓毒症组中高表达的有6个物质:棕榈酰- L -肉碱、肌酐、苯丙氨酸、异烟酸、胆碱、5-氮胞苷,低表达的有4个物质:1-氧-十六烷基-2-甘油-3-磷酰胆碱、丙氨酸、4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶和不对称二甲基精氨酸。 结论:在脓毒症状态下,机体的能量代谢明显加强。我们利用代谢组学的方法从淋巴液中找到了10个潜在的生物标志物,其中与脂肪代谢和蛋白质代谢相关的就有5个(棕榈酰- L -肉碱、肌酐、苯丙氨酸、胆碱、丙氨酸),另外与微循环直接相关的不对称二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶的内源性抑制剂,在脓毒症状态下ADMA的减少可以相对增加一氧化氮合成酶的活性,所以在炎症的早期可以调节血管的张力,有利于机体抵抗脓毒症时过度的炎症反应。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R459.7

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