TGF-β1在TAO眼外肌纤维化中的作用及相关信号传导通路研究

【摘要】：目的 甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)眼外肌纤维化在病理学上具有不可逆的特点,可导致患者出现斜视、复视,甚至压迫性神经病变而导致失明。目前发病机制不明,药物及手术治疗效果均欠佳。TGF-β1是导致纤维化最重要的细胞因子之一,可通过促使成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)表型转分化及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成,最终导致纤维化的形成。在此过程中,MFB持续存在或凋亡过程缺陷可导致纤维化进行性发展(α-SMA是MFB标志性蛋白),MFB成为控制纤维化的重要靶细胞。而TGF-β1是一种多功能的细胞因子,具有抑制炎症反应及抗肿瘤作用,若直接阻断TGF-β1抗纤维化则对机体产生不利的影响。因此,希望在阐明TGF-β1致纤维化作用机制的同时寻找其下游信号通路,结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)属于即可早期基因CNN家族,在TGF-β1作用下,可由成纤维细胞分泌,CTGF能被多种因子转录激活,其中以TGF-β1最引人注目,在TGF-β1的下游发挥重要的生物学作用。本课题旨在通过体外培养TAO眼外肌来源的成纤维细胞(orbital fibroblasts,OF),观察TGF-β1能否通过促进成OF增殖、向MFB表型转分化及ECM的合成,最终导致TAO眼外肌纤维化的形成。同时选择TGF-β1/Smads、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号传导通路,利用特异性抑制剂(SB431542 for TGF-β1/Smads、SB203580 for P38/MAPK、PD98059 for ERK/MAPK、SP600125 for JNK/MAPK、LY294002 for PI3K)分别阻断其相应的信号传导通路,初步探讨TGF-β1促进OF转分化为MFB及诱导OF表达CTGF的信号传导通路,同时观察了CTGF对OF转分化为MFB的作用以及CTGF自分泌调节的信号传导通路,希望进一步明确TGF-β1在TAO眼外肌纤维化中的发病机制,为TAO眼外肌纤维化治疗提供相应的分子靶点。 方法 1.应用免疫组化SP法检测TGF-β1、CTGF、P-Smad2/Smad3、Smad4、Smad7在TAO患者眼外肌中的表达; 2.采用组织块贴壁法原代培养TAO患者眼外肌来源的成纤维细胞并采用HE染色及免疫细胞化学技术进行鉴定; 3.采用Real-time PCR观察TGF-β1诱导OF表达ECM主要成分TIMP-1 mRNA、COL-I mRNA、COLIII mRNA及FN mRNA水平的变化;采用细胞免疫荧光观察TGF-β1诱导OF表达TIMP-1、COL-I、COL III及FN蛋白及其定位; 4.采用MTT法检测TGF-β1诱导OF增殖的效应;Real-time PCR和Western-blot检测TGF-β1诱导OF合成α-SMAmRNA、CTGF mRNA及蛋白水平变化;预先添加各种信号通路抑制剂(SB431542 for TGF-β1/Smads、SB203580 for P38/MAPK、PD98059 for ERK/MAPK、SP600125 for JNK/MAPK、LY294002 for PI3K)后,采用Real-time PCR和Western-blot检测TGF-β1诱导OF合成α-SMAmRNA、CTGF mRNA及蛋白水平变化;细胞免疫荧光检测α-SMA、CTGF蛋白表达定位及Smad3磷酸化变化;Western-blot检测SB431542抑制剂对MAPK家族(p38、ERK、JNK)磷酸化的影响;同时采用Real-time PCR检测CTGF诱导OF转分化作用及CTGF自身调节信号传导通路。 结果 1.免疫组化结果显示TAO眼外肌组织成纤维细胞及内皮细胞中存在较正常眼外肌高表达的TGF-β1、CTGF、P-Smad2/Smad3、Smad4,但Smad7在TAO纤维化眼外肌组中较正常眼外肌低表达; 2.甲状腺相关眼病眼外肌来源成纤维细胞原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形,细胞免疫化学鉴定:波形蛋白(Vimentin)染色阳性,而角蛋白(Keratin)、结蛋白(Desmin)、S~(-1)00染色均阴性,证明为中胚层来源的成纤维细胞; 3.Realtime-PCR检测10μg·L~(-1)TGF-β1刺激OF的时间效应:TIMP~(-1) mRNA在3 h和6 h分别为对照组的1.50倍和2.46倍(P0.01); COL-I mRNA在24 h和48 h分别为对照组的5.49、3.69倍(P0.01);COL-IIImRNA在24 h和48 h分别为对照组的2.14、1.63倍(P0.01);FN mRNA在12 h和24 h后分别为对照组的2.45、1.53倍(P0.01)。不同浓度TGF-β1刺激OF 24 h后剂量效应:与空白对照组相比,TIMP~(-1)mRNA在5μg·L~(-1)和10μg·L~(-1)时分别为1.79、1.46倍(P0.01); COL-I mRNA在1μg·L~(-1)和10μg·L~(-1)分别1.94、3.29倍(p0.01); COL- III mRNA在5μg·L~(-1)和10μg·L~(-1)分别1.52、3.28倍(P0.01);FN mRNA在1μg·L~(-1)和10μg·L~(-1)分别为1.30、2.45倍(P0.01);细胞免疫荧光染色显示TIMP~(-1)、COL-I、COL III及FN蛋白的表达位于OF细胞浆; 4.MTT法检测显示TGF-β1(1～10μg·L~(-1)TGF-β1)可促进OF增殖,各浓度与对照组相比(P0.05); Realtime-PCR和Western-blot检测显示在一定的浓度范围内,TGF-β1均以时间和剂量依赖的方式诱导OF表达α-SMA、CTGF mRNA,各浓度与空白对照组相比,(P0.05)其中CTGF mRNA在12h达到高峰,α-SMA mRNA在24h达到高峰,SB431542显著抑制剂了α-SMA mRNA的表达(与对照相比,P0.05),同时PD98059、SB203580也抑制剂了α-SMA mRNA的表达(与空白对照相比P0.05);SB431542和SP600125抑制了CTGFmRNA的表达(与对照相比,P0.05);Western-blot检测出相对应的结果;同时Western-blot检测TGF-β1诱导OF,可使Smad3磷酸化改变,在30min时达到顶点;SB431542抑制剂对MAPK家族磷酸化没有影响。同时Realtime-PCR检测一定的浓度范围内(0.5～50μg·L~(-1))CTGF可以试剂和剂量依赖的方式诱导OF转分化表达α-SMA mRNA,(与对照组相比P0.05)SB431542和SP600125抑制了CTGF自分泌的表达(与对照相比,P0.05),细胞免疫荧光检测出10μg·L~(-1)TGF-β1诱导OF表达α-SMA和CTGF蛋白,定位于OF细胞浆;细胞免疫组化观察到OF表达α-SMA。 结论 1.TGF-β1、CTGF、P-Smad2/Smad3、Smad4在TAO患者眼外肌组织中较正常组织中高表达,而Smad7则相反,表达定位于成纤维细胞,少量表达在内皮细胞,TGF-β1/Smad通路可能参与了TAO眼外肌纤维化的发病过程; 2.组织块贴壁法培养的细胞符合甲状腺相关眼病眼外肌成纤维细胞的形态学和免疫学特征,可作为研究甲状腺相关性眼病眼外肌纤维化的体外模型; 3. Realtime-PCR显示在一定的浓度范围内,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导OF表达细胞外基质主要成分TIMP~(-1)、COL-I、COL III及FN mRNA;细胞免疫荧光染色显示TGF-β1可诱导OF表达TIMP~(-1)、COL-I、COL III及FN蛋白,蛋白位于OF细胞浆;TGF-β1可通过促进ECM的合成参与TAO眼外肌纤维化的发病过程。 4. TGF-β1对OF增殖有增加的趋势,但P0.05,无统计学意义;TGF-β1可诱导OF向MFB表型转分化及表达CTGF,CTGF的表达高峰早于α-SMA;CTGF可诱导OF向MFB表型转分化;细胞免疫荧光可检测到α-SMA及CTGF蛋白的表达并定位于OF细胞浆;TGF-β1诱导OF向MFB表型转分化表达α-SMA通TGF-β1/Smad及P38/MAPK和ERK/MAPK信号传导通路;TGF-β1诱导OF表达CTGF通TGF-β1/Smad及JNK/MAPK信号传导通路;CTGF自分泌调节通过JNK/MAPK信号传导通路;TGF-β1可引起Smad3磷酸化改变,SB431542对MAPK信号通路磷酸化水平没有影响。

【关键词】：甲状腺相关性眼病 眼眶成纤维细胞 纤维化 TGF-β1 信号通路传导
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R581.1;R771.3
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