Hippo通路在常染色体显性多囊肾病发病机制中的作用研究

【摘要】：研究背景和目的 常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidneydisease，ADPKD）是一种常见的遗传性肾脏疾病，以双肾出现多发性进展性的液性囊泡为特点，除引起肾衰竭外，还累及多种肾外器官，如肝囊肿、胰胆管扩张、结肠憩室、脑动脉瘤、心脏瓣膜畸形等表现，是一种系统性疾病，严重危害人类健康。进入终末期肾衰竭的患者需要依靠透析或肾移植维持生命，给社会和家庭带来巨大负担。目前已知ADPKD致病基因主要为pkd1和pkd2，但该病的发病机制尚未完全阐明，目前主要有“二次打击”和“纤毛致病”两种理论学说。囊肿衬里上皮细胞过度增殖是其发病机制之一，因此，ADPKD也被称为类肿瘤疾病。现有研究已证明，ADPKD肾脏囊肿发生及进展的病理生理过程主要是：肾囊肿衬里上皮细胞类肿瘤样持续增殖与凋亡异常；细胞极性改变和分化不良及囊腔液体在囊肿内大量聚集积聚，挤压周围肾实质。上述过程使得正常肾组织不断产生新的囊肿，现有囊肿也逐渐增大，压迫正常肾组织，最终发展为终末期肾病。 作为一种类肿瘤性疾病，ADPKD与调控器官大小的信号通路改变密切相关。mTOR信号通路是与细胞异常增殖、肿瘤发生密切相关的通路之一。近年来，有学者发现了除mTOR通路之外的另一条专一参与器官大小调控的信号通路，即Hippo通路，后者主要通过综合调控细胞增殖和凋亡发挥控制器官大小的作用。正是由于Hippo通路的重要功能，使得其在人类肿瘤及其他疾病的发病机制中扮演了重要的角色。 Hippo蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，Hippo信号通路于2007年采用遗传镶嵌扫描技术在果蝇中发现Hippo激酶后命名。Hippo通路在哺乳动物中高度保守，目前有很多研究证明，该通路主要信号分子对器官生长的大小具有重要的调控作用。现有证据表明，Hippo通路对肿瘤发生具有重要影响。人肾癌细胞系ACHN和人黑色素瘤组织中分别观察到SAV1和Mob1基因的突变，结肠癌组织中Mob1表达较正常结肠组织明显下调。Lats1/2的下调现象存在于多种肿瘤（如人类卵巢癌、侵袭性乳腺癌、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤和急性淋巴细胞白血病等）中；人类软组织肉瘤和结肠癌中也观察到Mst1/2表达的降低；在肝脏中同时条件性敲除Mst1和Mst2基因也可引起巨大肝细胞癌，但在这种小鼠中再次敲除YAP基因则可逆转肝癌细胞表型。作为Hippo通路下游的主要效应分子，在人类多种肿瘤（如肝癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌）中也观察到YAP的表达和核转位的增加。 作为近年来新发现的一条信号通路，到目前为止，Hippo通路在ADPKD中的研究仅限于该通路靶蛋白YAP在ADPKD动物模型Pkd-1基因敲除小鼠囊肿衬里上皮细胞与扩张的肾小管上皮细胞中的表达变化，但Hippo通路中其他分子的改变及其在人类肾脏与其它动物模型中的变化，尚未见报道。此外，Hippo通路是否与细胞增殖相关的其它信号通路存在联系，共同引起上皮细胞生长发育和凋亡异常也尚无研究。因此，本研究旨在观察Hippo通路分子及靶分子YAP与TAZ在ADPKD肾组织中的表达变化，探讨Hippo通路分子对于肾囊肿衬里上皮细胞过度增殖的影响及其机制，为临床寻找治疗多囊肾病的有效药物奠定实验及理论基础。 实验方法 1.采用免疫荧光化学染色及激光共聚焦方法，观察Han:SPRD大鼠杂合型及野生型肾组织中LATS1、YAP及TAZ的表达及分布变化； 2.采用Western blotting方法检测Han:SPRD大鼠杂合型及野生型肾组织中LATS1、磷酸化LATS1、YAP、磷酸化YAP及TAZ蛋白水平表达差异； 3.采用Real-time PCR方法检测ADPKD患者与正常对照肾组织中MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ mRNA的表达变化； 4.采用MTT法观察用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP和TAZ表达后对细胞生长增殖能力的影响。 5.采用流式细胞术与Western blotting法检测用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP与TAZ表达后细胞凋亡的变化； 6.采用流式细胞术检测用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP与TAZ表达后细胞周期的变化；并用Real-time PCR与Westernblotting法在mRNA和蛋白质水平验证细胞周期改变相关蛋白的表达； 7.采用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后，用Western blotting法检测YAP蛋白及YAP磷酸化水平变化，以验证WT9-12细胞中，LATS1是否为YAP磷酸化的主要蛋白； 8.采用MTT法发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后对细胞增殖的影响； 9.采用流式细胞术与Western blotting法检测用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后细胞凋亡的变化； 10.采用流式细胞术检测用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后细胞周期的变化；并用Western blotting法验证细胞周期相关蛋白表达变化。 结果 1.采用免疫荧光化学染色及激光共聚焦方法发现Han:SPRD大鼠杂合型肾囊肿衬里上皮细胞LATS1表达较野生型明显减弱，但YAP却呈强阳性表达，且在胞浆与胞核中均有分布，而野生型仅在于胞浆中微弱表达，胞核内无YAP分布；TAZ的表达与分布在杂合型和野生型大鼠无明显差异； 2.采用Western blotting方法发现在Han:SPRD大鼠杂合型肾组织中LATS1和磷酸化LATS1蛋白表达量较野生型明显降低；YAP蛋白表达量则较野生型多，而磷酸化YAP蛋白表达水平显著减少；TAZ蛋白表达二者无明显差异； 3.采用Real-time PCR方法发现发现ADPKD患者肾组织中MST1/2、LATS1和TAZ的mRNA表达均较正常对照肾组织降低，YAP的mRNA表达二者无明显差异； 4.采用MTT法发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP表达可抑制细胞的生长增殖能力，48、72和96小时细胞增殖的抑制率分别为22.66%、31.41%和33.37%；而下调TAZ对WT9-12细胞仅有轻微的抑制作用； 5.采用流式细胞术发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP与TAZ表达后不增加WT9-12细胞的凋亡率，Westernblotting法也表明促凋亡蛋白caspse-3的底物PARP蛋白无明显变化，说明下调YAP与TAZ不能诱导细胞凋亡； 6.采用流式细胞术发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中YAP表达48小时时能使细胞周期阻滞在G0/G1期，Real-time PCR与Westernblotting还发现G0/G1期特异性周期调控蛋白CyclinD1与CyclinE的表达在mRNA和蛋白质水平均有下调，而周期负性调节蛋白P21表达则明显上调；但TAZ表达变化不显著； 7.采用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后，用Western blotting法发现细胞中YAP蛋白表达无明显影响，但YAP磷酸化水平有显著抑制作用，表明在WT9-12细胞中，LATS1是磷酸化YAP的主要蛋白，LATS1表达下调可增加YAP的活化水平； 8.采用MTT法发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达可促进细胞增殖，24、48、72和96小时WT9-12细胞增殖率分别为113.22%、116.27%、111.80%和106.81%； 9.采用流式细胞术发现用RNAi特异性抑制WT9-12细胞中LATS1表达后对WT9-12细胞凋亡无明显影响，Western blotting法也表明诱导细胞信号通路信号分子caspse-3的底物PARP蛋白裂解无明显改变，说明下调LATS1不能抑制细胞凋亡； 10.采用流式细胞术发现用RNAi特异性下调WT9-12细胞中LATS1表达48小时能促进细胞周期，使更多细胞处于S期；Westernblotting分析发现S期特异性周期调控蛋白CyclinA的表达明显上调，G0/G1期特异性周期调控蛋白CyclinD1与CyclinE表达也有所上调，而负性调控蛋白P21的表达却明显下调，表明LATS1能抑制促进WT9-12细胞周期调控相关蛋白的表达，促进细胞周期，导致囊肿衬里上皮细胞增殖。 结论 通过ADPKD患者和实验动物肾组织样本的组织学观察、基因表达的mRNA和蛋白质水平都证明肾小管上皮细胞内Hippo信号通路被抑制，YAP去磷酸化活性增强是导致常染色体多囊肾病发生的重要原因之一。体外细胞实验证实降低YAP磷酸化活性可以抑制肾囊肿衬里上皮细胞的增殖，且这种抗细胞增殖作用是通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制细胞分裂实现的；且YAP磷酸化活性是受其上游信号分子LATS1调控的。