电针对化疗及炎症相关疼痛的作用及机制

【摘要】：背景 针灸在中国以及其他亚洲国家的应用已有两千多年的历史，疼痛是针灸的主要适应症之一。早期研究证实，针灸对腰背痛、膝关节痛等有较好疗效。一个小型临床试验发现，针灸亦可改善肿瘤患者化疗相关的神经痛症状。针灸镇痛的机制尚未完全明了，目前，研究比较明确的是，阿片类受体是针灸镇痛的主要靶点之一，进一步的实验表明，μ和δ阿片类受体参与介导电针（EA）治疗完全弗氏佐剂（CFA）和辣椒素诱导的炎性疼痛以及大鼠尾干受伤引起的神经痛，因此，电针亦有可能通过阿片类受体治疗化疗相关神经痛。另一方面，研究数据证实，针灸可有效治疗炎性疼痛，脊髓腰膨大胶质细胞分泌的细胞因子可能是其起效靶点之一，并且脊髓腰膨大星状胶质细胞和小胶质细胞的活化被认为与炎性疼痛密切相关。白细胞介素17（IL-17）是最新发现的一类细胞因子，一般认为，其主要由TH17细胞分泌，并且主要介导自身免疫性疾病，最近的研究提示，在中枢神经系统的胶质细胞中亦可观察到IL-17的表达，另有研究表明，外周IL-17可介导关节及神经痛，因此，脊髓腰膨大的胶质细胞中亦可能存在IL-17表达，并且其很可能与炎性疼痛相关。我们前期研究发现，脊髓腰膨大胶质细胞分泌的IL-1β等细胞因子参与介导针灸镇痛。以此类推，如果脊髓IL-17参与介导炎性疼痛，那么，这种细胞因子也可能介导针灸镇痛。 目的 第一，研究针灸是否可以抑制化疗相关神经痛以及阿片类受体是否参与介导针灸治疗化疗痛；第二，观察炎性痛大鼠模型脊髓细胞是否表达IL-17，如果表达，IL-17是否参与介导炎性疼痛，以及IL-17是否介导针灸镇痛。 方法 实验共分为七个部分，一、电针对紫杉醇诱导的化疗痛的干预作用；二、阿片类受体在电针治疗化疗相关疼痛中的作用；三、免疫组化法检测IL-17及其受体在炎性痛模型大鼠脊髓中的表达；四、IL-17抗血清对炎性痛模型大鼠热缩足阈值的影响及其对IL-17RA的表达和NR1磷酸化的调控作用；五、IL-17蛋白椎管注射对正常大鼠脚掌热缩足阈值的影响及其对IL-17RA的表达和NR1磷酸化的调控作用；六、电针对CFA诱导的痛觉过敏的作用以及电针对的脊髓IL-17、IL-17RA、p-NR1表达的影响；七、电针对IL-17诱导的痛觉过敏的作用及机制 实验一，动物随机分为4组，即模型+假电针组（paclitaxel+sham EA），模型+高频电针组（paclitaxel+100Hz），模型+低频电针组（paclitaxel+10Hz EA），模型对照+假电针组(vehicle+sham EA)，每组7只。分别于紫杉醇注射前、注射后第13天（电针前），注射后第14、16、18、20天（每次电针后30分钟），采用2、4、6和15g弗莱毛检测大鼠的机械缩足阈值。 实验二,紫杉醇腹腔注射后的动物随机分为8组，即生理盐水+电针组（paclitaxel+Vehicle+EA）,生理盐水+假电针组(paclitaxel+Vehicle+sham), CTOP+电针组（paclitaxel+CTOP+EA），CTOP+假电针组（paclitaxel+CTOP+Sham），Naltrindole+电针组（paclitaxel+Naltrindole+EA）， Naltrindole+假电针组（paclitaxel+Naltrindole+Sham），nor-BNI+电针组（paclitaxel+nor-BNI+EA），nor-BNI+假电针组（paclitaxel+nor-BNI+Sham），每组7只。三种受体阻滞剂均溶于生理盐水，于紫杉醇注射后14、16、18和20天进行脊髓给药，给药后10分钟实施电针。行为学测试同实验一。 实验三，免疫荧光双标法检测模型鼠IL-17的表达。本实验共分为两个部分，1、CFA脚掌注射后的大鼠被随机分为注射后2小时和24小时组，每组3只，另外3只大鼠作为对照组，于脚掌注射生理盐水24小时后取材。大鼠脊髓腰膨大被用作免疫荧光染色，进行IL-17的计数和定位（与星状胶质细胞标志物GFAP，小胶质细胞标志物OX-42和神经细胞标志物NeuN双标）；2、取CFA24小时组的脊髓腰膨大切片，免疫荧光双标IL-17RA和NR1，观察IL-17RA是否表达在含NMDAR的神经细胞上。 实验四，观察IL-17抗血清是否可以缓解CFA引起的炎性疼痛。CFA或生理盐水同时分别注射于不同组大鼠的左脚掌，CFA大鼠随机分为三组，对照组，0.2或2μg IL-17抗血清组。IL-17抗血清共椎管注射三次，分别于CFA注射前24小时（阻断IL-17的基础分泌），以及每次行为测试前2小时（阻断CFA诱导的IL-17分泌），对照组在同样的时间点椎管注射10μl生理盐水。脚掌注射生理盐水的大鼠与CFA大鼠采取同样的处理。热缩足阈值分别于CFA注射前48小时（基础值），以及注射后2小时、24小时检测。行为测试完成后取大鼠脊髓腰膨大同侧（CFA注射侧）背角，western blot法检测IL-17RA、p-NR1的表达。 实验五，正常大鼠随机分为5组，分别椎管注射10μl生理盐水，10ng、100ng、400ng IL-17或400ng IL-17+2μg IL-17抗血清，热缩足阈值分别于CFA注射前48小时（基础值），以及注射后2小时、24小时、48小时检测。因为IL-17在注射第24小时时对大鼠热缩足阈值的影响最大，另取5组同样处理的大鼠，于IL-17椎管注射后24小时获取脊髓腰膨大背角，western blot法检测IL-17RA、p-NR1的表达。 实验六，动物随机分为3组，模型+电针组（CFA+EA）、模型+假电针组（CFA+Sham），对照+假电针组（Saline+Sham），每组7只。分别于CFA注射前48小时（基础值）、注射后2小时和24小时监测大鼠的热缩足阈值，行为学测试完成后，免疫组化法检测脊髓腰膨大IL-17的表达，Western blot法监测IL-17RA、p-NR1的表达。 实验七，动物随机分为3组，即生理盐水+假电针组（Saline+Sham）、IL-17+假电针组（IL-17+Sham）、IL-17+电针组（IL-17+EA），每组8只。注射后2小时和24小时监测大鼠的热缩足阈值，行为学测试完成后， Western blot法监测IL-17RA、p-NR1的表达。 结果 1、紫杉醇注射后第13到第20天，施以假电针的化疗痛模型大鼠对不同机械刺激的反应率明显高于非疼痛对照组(P0.05).与模型+假电针组相比，10Hz电针可明显降低模型大鼠对4、8、15g弗莱毛的反应率(P0.05)，但是100Hz电针仅对15g弗莱毛的反应率有影响. 2、对于椎管注射生理盐水的化疗痛模型大鼠，与假电针组相比，电针可明显降低大鼠对不同机械刺激的反应率(P0.05)；但是椎管注射μ阿片类受体拮抗剂（CTOP）的化疗痛模型大鼠，施以电针后，与椎管注射生理盐水的化疗痛模型鼠施以假电针后对各机械刺激的反应无明显差异(P0.05)；对于施以假电针的化疗痛模型大鼠，椎管注射CTOP与椎管注射生理盐水无差异(P0.05)。椎管注射δ或κ阿片类受体拮抗剂与注射CTOP的结果类似。 3、免疫荧光双标法表明，IL-17在脊髓腰膨大与星状胶质细胞标记物GFAP共表达。在CFA炎性痛大鼠模型，同侧（CFA注射侧）背角I-II层，IL-17在CFA注射后2小时、24小时计数均高于生理盐水组(P0.01).对侧I-II层IL-17阳性细胞同样轻度升高，但与生理盐水组相比无统计学差异(P0.05)。在CFA注射后24小时，同侧、对侧I-II层的IL-17表达亦存在明显差异(P=0.039).在背角V-VI层，与生理盐水组相比，CFA注射两小时后，双侧IL-17阳性细胞数均明显升高(P0.05)。CFA注射24小时后，仅同侧IL-17阳性细胞数升高(P=0.034)。在背角X层，与生理盐水组相比，IL-17在CFA注射后两小时明显升高(P=0.049)，但是注射后24小时无明细差异（P=0.167）。在背角III-IV层，各组间IL-17表达无明显差异(P0.05)。免疫荧光双标法表明，IL-17RA与NR1表达在同一类脊髓神经细胞中 4、 IL-17抗血清可明显抑制CFA炎性痛模型大鼠的热痛觉过敏，此效应呈剂量依赖，重复测量方差分析显示，药物主效应(p 0.05),时间(P0.001)，时间和药物交互效应(P=0.84)。组间比较显示，与生理盐组相比，2μg IL-17抗血清椎管注射可明显提高炎性痛大鼠的同侧热缩足阈值(P0.05)。IL-17对CFA注射对侧脚掌无影响。Western-blot显示，p-NR1在CFA炎性痛大鼠模型脊髓背角明星升高，与非模型组（脚掌注射生理盐水）相比，P0.05,这种升高可被椎管注射2μg IL-17明显抑制(P0.05).IL-17RA在CFA炎性痛大鼠模型脊髓背角明星升高，与非模型组（脚掌注射生理盐水）相比，P0.05；与椎管注射生理盐水或0.2μg IL-17抗血清相比，2μg IL-17抗血清可使CFA炎性痛大鼠IL-17RA表达明显降低(P0.05). 5、IL-17椎管注射可引起大鼠热缩足阈值降低，此效应呈剂量依赖。注射400ngIL-17，在2小时后开始起效，24小时后达到峰值，48小时后恢复正常。重复测量方差分析显示：药物主效应(P0.001),时间效应(P0.0001)，药物和时间交互效应(P0.05)。组间比较显示，与生理盐水组相比， IL-17100ng和400ng在椎管注射后第2-24小时可使大鼠热缩足阈值明显升高（分别为P0.01和P0.0001）。IL-17与IL-17抗血清联合注射则不存在这种影响。 与行为学测试一致，IL-17可引起NR1磷酸化的升高，此效应呈剂量依赖。IL-17抗血清可阻断这种效应。 同样，IL-17可引起IL-17RA的升高，此效应呈剂量依赖。IL-17抗血清可阻断这种效应。 6.热缩足阈值测试结果显示，与假电针组相比，电针实施后2-24小时可有效抑制CFA引起的痛觉过敏。重复测量方差分析结果显示：CFA注射同侧，药物主效应(P0.01),时间效应(P0.01)，药物和时间交互效应(P0.01).组间比较显示，与生理盐水组相比， CFA第2-24小时可使大鼠热缩足阈值明显降低(P0.01)。电针可显著抑制这种降低(P0.05)。CFA注射对对侧脚掌的热缩足阈值无显著影响，各组间比较（P0.05） 与非模型组相比，假电针组炎性痛模型大鼠的IL-17, P-NR1和IL-17RA表达水平均明显升高（P0.05）。电针可显著抑制这种升高(P0.05)。 7.热缩足阈值测试结果显示（双侧平均值），与假电针组相比，电针实施后2-24小时可有效抑制IL-17椎管注射引起的痛觉过敏。重复测量方差分析结果显示：治疗主效应(P0.01),时间效应(P0.01)，药物和时间交互效应(P0.01).组间比较显示，与生理盐水组相比，IL-17第2-24小时可使大鼠热缩足阈值明显降低(P0.01)。电针可显著抑制这种降低(P0.05)。 与非模型组相比，椎管注射IL-17的假电针组大鼠的p-NR1和IL-17RA表达水平均明显升高(P0.05)。电针可显著抑制这种升高(P0.05)。 结论 1、电针可通过上述三种阿片类受体有效抑制化疗引起的神经痛；电针可做为化疗相关疼痛的一种有效替代治疗手段。 2、脊髓星状胶质细胞可表达IL-17，脊髓IL-17可通过诱导NR1的磷酸化引起炎性疼痛。 3、电针可通过抑制脊髓IL-17的表达缓解炎性疼痛。 4、这些结果支持在临床中应用电针治疗化疗或炎症相关疼痛。

【关键词】：针灸 紫杉醇 化疗痛 阿片类受体 炎性痛 痛觉过敏 白细胞介素17 NMDAR1 脊髓 胶质细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R245
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