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富氢水对大鼠急性一氧化碳中毒脑损伤保护作用及其机制研究

沈美华  
【摘要】:一氧化碳(carbon monoxide CO)中毒是一种常见的中毒性疾病,严重危害着人类的健康和生命。部分重度中毒患者常因累及大脑、心脏等多个重要脏器,即使挽救了生命,也常留下迟发性神经精神后遗症,严重影响了生存者的生活质量,给家庭和社会带来了巨大的负担。因此,如何尽早对急性CO中毒脑损伤采取有效治疗手段并防治迟发性中毒后脑病(Delayed neurologic sequelaeDNS),已经成为临床上迫切需要解决的问题。 自由基损伤是急性CO中毒脑损伤的主要发病机制。自由基与人类的健康和疾病密切相关,是当前生命科学研究的热点。过量产生的自由基会导致DNA、脂质和蛋白的氧化损伤,其中羟自由基(.OH)和过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)毒性强,目前为止还没有在哺乳动物体内发现内源性的有针对性的清除方式。2007年,有学者在《Nature medicine》报道,动物呼吸2%的氢就可有效清除自由基,显著改善脑缺血再灌注损伤。 本课题采用吸入法建立大鼠急性CO中毒脑损伤模型,该模型为CO中毒的常用模型,大鼠与人类的大脑结构相似,能很好地模拟人脑缺血缺氧的过程。观察氢饱和的生理盐水(简称为富氢水)对急性CO中毒脑损伤大鼠的保护效应,通过症状学、病理学、形态学、行为学等不同指标分别评价富氢水对皮层区以及海马区的保护效应。并从两方面探讨富氢水对急性CO中毒脑损伤保护作用的机制:(1)富氢水治疗对大鼠急性CO中毒后氧自由基及相关抗氧化酶的作用。主要观察急性CO中毒后腹腔注射富氢水,大鼠大脑皮层和海马的氧化应激系统的变化;(2)急性CO中毒后予以富氢水治疗对大鼠神经元细胞凋亡的影响,并测定凋亡酶活性和凋亡相关蛋白变化。通过本课题的实施,旨在为富氢水用于临床治疗急性CO中毒脑损伤提供实验依据。 一、富氢水对大鼠急性CO中毒脑损伤的保护效应 目的:研究腹腔注射富氢水对大鼠急性CO中毒脑损伤是否具有保护效应;同时分别观察皮层和海马对富氢水治疗的反应。 方法:采用吸入法制作急性CO中毒模型,腹腔注射富氢水治疗。动物分为正常对照组(Control)、CO+生理盐水(NS)组、CO+富氢水(Hydrogen)组。造模后24小时观察各组动物的一般精神行为状态、体重变化,14天生存情况,根据Brailowsky描述的神经学评分方法对神经功能缺损进行症状评估,测定脑组织含水量,采用脑组织灌流切片,行HE、NISSL染色,并在镜下对神经细胞进行计数。观察建模后存活14天大鼠的水迷宫实验,评价其空间记忆能力。 结果:富氢水治疗组的动物在建模后24小时精神状态较好,毛色光滑,较为活泼,反应迅速,主动摄入食水,体重下降不明显,其结果明显优于生理盐水组(14.173.76g vs.18.52.43g;P0.05);富氢水治疗组的生存率明显增高(80%vs.60%;P0.05);神经功能缺失症状减轻明显(13.831.94vs.16.831.72;P0.05);脑组织水含量低(0.790.04vs.0.880.04;P0.01)。HE和NISSL染色均表明富氢水对皮层(NISSL:88.5022.88vs.58.6716.18;P0.05)和海马(NISSL:102.8326.36vs.51.6716.79,P0.01)有明显的保护作用。2周后水迷宫测试提示富氢水治疗组逃避潜伏期短于生理盐水组(22.674.03vs.32.334.59,P0.05)。 结论:1、吸入法模拟急性CO中毒模型制作方法相对简单,重复性好,能比较好地应用于观察动物急性CO中毒后各项指标的变化以及干预措施的疗效比较;2、富氢水注射对大鼠急性CO中毒脑损伤有保护作用。 二、富氢水通过调节氧化应激系统对大鼠急性CO中毒脑损伤的保护作用 目的:研究富氢水的保护效应是否与清除氧自由基、上调抗氧化酶的活性有关。 方法:按照第一部分的方法进行建模和治疗。对大鼠皮层和海马分别取材,制作组织匀浆,根据试剂盒说明用硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量,酶联免疫吸附测试法(ELISA)测定8-羟基鸟嘌呤(8-OHdG)含量,羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力,比色法测定脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力。 结果:CO中毒后24小时,与生理盐水组相比,富氢水能降低皮层(1.420.44vs.2.040.44,P0.05)和海马(1.910.68vs.3.170.69,P0.01)的MDA含量;降低8-OHdG的含量(皮层54.64±4.93vs.62.98±9.08,P0.05);海马60.43±10.49vs.82.66±12.55,P0.01);增强抗氧化酶的活性,如SOD(皮层111.35±44.95vs.46.23±28.78,P0.05;海马173.08±51.43vs.89.11±35.38,P0.01),但对GSH-px影响不明显(皮层5.41±1.41vs.5.25±0.89,P0.05;海马6.19±2.67vs.5.87±2.38,P0.05)。 结论:1、大脑皮层和海马对急性CO中毒均有明显的氧化应激反应;2、富氢水的保护作用可能是通过上调内源性抗氧化酶、清除氧自由基发挥作用。 三、富氢水通过抑制过度凋亡对急性CO中毒脑损伤的保护作用 目的:研究富氢水的保护效应是否与抑制神经细胞过度凋亡有关。 方法:按照第一部分的方法进行建模和治疗。采用TUNEL法检测细胞凋亡;ELISA法检测caspase-3和caspase-9的酶活性;Western Blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。 结果:CO中毒后24小时,与生理盐水组相比,富氢水能明显减少皮层(57.677.58vs.99.508.73,P0.01)和海马区(52.3313.17vs.82.1715.79)的凋亡阳性细胞数;降低皮层和海马的caspase-3酶(皮层0.0290.008vs.0.0650.009,P0.01vs. CO+NS group;海马0.0310.004vs.0.0530.007,P0.01)和caspase-9酶(皮层1.1960.384vs.1.7970.432,P0.01;海马1.2080.112vs.1.8970.280,P0.01)相对活性;也提高了Bcl-2在皮层以及海马(皮层1.363±0.183vs.0.886±0.070,P0.01;海马1.166±0.139vs.0.807±0.067,P0.01)的表达,但对Bax水平影响不明显(皮层0.515±0.038vs.0.494±0.029,P0.05;海马0.437±0.107vs.0.410±0.034,P0.05)。 结论:1、急性CO中毒后,大鼠大脑皮层和海马均呈现不同程度的凋亡;2、抑制凋亡可能是富氢水保护作用机制之一。


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