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《第二军医大学》 2012年
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多发性骨髓瘤血浆miRNA分子标志物研究

黄晶晶  
【摘要】:多发性骨髓瘤(MM)是骨髓浆细胞恶性肿瘤。患者骨髓中克隆性浆细胞异常增生,并分泌单克隆免疫球蛋白或其片段,导致相关器官或组织损伤。常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全和免疫力低下等。 几乎所有的MM患者都具有多个复杂的基因异常。基因异常可总的分为超二倍体和非超二倍体亚型。近半数的骨髓瘤的病例是非超二倍,其中大多具有IgH转位;而超二倍体亚型骨髓瘤细胞具有三体性染色体导致染色体数目为奇数。许多研究发现的基因异常与疾病进展和生存期相关,如RAS的突变、MYC失调、13号染色体和17号染色体的缺失、1号染色体异常以及NF-κB激活等。尽管在多发性骨髓瘤的分子遗传学方面的研究取得进展,但该疾病的始发与进展机制仍然有待阐明。 有研究发现属于ncRNA范畴的microRNA(miRNA)不仅在胚胎发育和细胞分化上可能发挥关键作用,而且与肿瘤的发生也密切相关。到目前为止,在人类的基因组中发现的miRNA分子超过1000个。每个miRNA分子都有数百个不同的保守或非保守靶基因,据估计有50%的基因受miRNA调控。几乎全部已发现的miRNA分子在相邻物种中呈高度保守,暗示了其功能上的保守性。miRNA已被证明在不同基因表达调控途径,包括胚胎发育、细胞凋亡、细胞分裂、分化、造血作用及癌症发生等方面都具有重要的作用。很多实验证实miRNA在肿瘤组织中表达水平发生变化,具有致癌基因或抑癌基因的作用。对miRNA在不同组织和疾病中的表达谱分析发现, miRNA的表达谱具有明显的组织特异性,在一些疾病中miRNA的表达谱改变具有明显的特征,尤其是在肿瘤疾病中,与正常组织相比肿瘤组织中miRNA表达明显改变。此外,miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式,miRNA在肿瘤中表达的这些特点在肝癌、肺癌、肠癌、卵巢癌和白血病等多种恶性肿瘤中得到了证实。这些特点也使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标。 miRNA从肿瘤细胞中释放到体液中,可作为一系列癌症的诊断标记物。最近有研究报道miRNA分子可从乳腺癌细胞中释放到血液,乳汁和乳腺导管液中,这些体液中的miRNA分子可以作为癌症分子标记物的备选分子。为确认循环miRNA是否为肿瘤特异性的,有研究分析了多种癌症(黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌)术前患者的全血中的一系列的癌症相关miRNA水平。结果发现miR-195在乳腺癌患者中特异性增高,有别于其他癌症患者和健康人群。此外,在乳腺癌术后的患者循环miR-195和let-7a水平与健康对照人群相比显著下降。这些发现提示循环miRNA具有成为乳腺癌早期诊断的生物标记的潜能。循环miRNA可作为疾病诊断与预后判断的生物标记物,尤其对癌症的早期诊断与治疗策略的选择有重要意义。 近年来miRNA参与MM发病机理的研究较多。通过miRNA芯片检测发现,在MM患者的骨髓瘤细胞中miRNA-29b的表达水平显著下降,在人类骨髓瘤细胞株(HMCLs)中也发现这一现象。在HMCLs中过表达miR-29b,可诱导细胞凋亡和caspase-3活性增高。进一步研究发现miRNA-29b的靶基因为Mcl-1(myeloid-cell-leukemia1),通过抑制Mcl-1诱导细胞凋亡、提高caspase活性并拮抗IL-6在HMCLs中的促瘤作用。这一研究结果提示miR-29b在MM中充当重要的癌症抑制因子。MiR-106b~25群、miR-181a/b和miR-19a/b在MM骨髓浆细胞中与健康对照人群相比表达升高。此外miR-106b-25群、 miR-32、miR-181a/b和miR-19a/b下调SOCS1(为IL-6的抑制因子)和p300-CBP(为p53通路组分),抑制上述miRNA分子表达可抑制多发性骨髓瘤动物模型中骨髓瘤瘤体的生长。MiR-25和miR-30d可与TP53基因的3′非翻译区结合,并可降低p53蛋白水平、降低p53通路下游的基因表达。此外,miR-25和miR-30d可影响细胞凋亡、细胞周期停滞。在多个多发性骨髓瘤细胞株中抑制这两个分子的表达,可提高内生性p53的表达及促进细胞的凋亡。这个研究提示在骨髓瘤细胞株中的miR-25和miR-30d可负性调控重要的抑癌基因TP53。 基于以上研究现状,我们提出了一些疑问:多发性骨髓瘤患者外周循环中的miRNA表达是否有其特异性的改变?异常表达的miRNA对与疾病的诊断、预后有无关联呢?为了解决这些疑问,我们进行了以下三部分研究:1)测定多发性骨髓瘤患者血浆中miRNA表达谱;2)探讨miRNA与患者预后和临床特征有无关联。3)筛选出的miRNA分子是否参与多发性骨髓瘤的发生发展。 第一部分多发性骨髓瘤血浆miRNA表达谱的研究 miRNA是一类重要的非编码RNA,参与调控真核生物细胞许多种生物学过程。有关miNA在疾病中的研究,尤其是miRNA的异常表达与疾病发生发展的关系,引起研究者的广泛关注。 本部分实验主要目的是研究多发性骨髓瘤患者血浆miRNA表达谱,筛选出异常表达的miRNA。应用特异度较高的TaqMan microRNA芯片分析多发性骨髓瘤患者血浆miRNA的表达;应用软件分析分析多发性骨髓瘤与正常对照之间的差别;用real-time PCR分析进一步检测某些特定miRNA的表达。 结果显示,8个正常人和12个多发性骨髓瘤患者血浆miRNA表达谱并用SAM算法进行分析,多发性骨髓瘤患者血浆miRNA的表达与正常对照有明显的差别,经比较发现,患者与健康对照的血浆中共检测到135个miRNA分子,其中有6个miRNA在多发性骨髓瘤患者和正常人中表达差异显著,这六个miRNA(miR-148a、miR-20a、miR-99b、miR-221、miR-181a和miR-625)均表达上调。 第二部分多发性骨髓瘤血浆miRNA表达水平与基因亚型和染色体组型的关联 多发性骨髓瘤是具有高度异质性的疾病,其患者病程为诊断后数周到十年以上不等。有证据表明其高度异质性与肿瘤细胞的基因亚型相关。然而该疾病的预后判断缺乏简便可靠的指标,研究发现血清miRNA有望成为新兴的肿瘤诊断和预后的分子标志物。 本课题扩大研究对象,用real-time PCR方法进一步验证某些特定miRNA的表达。发现除miR-625之外,其余5个miRNA(miR-148a、miR-20a、miR-99b、miR-221和miR-181a)在多发性骨髓瘤患者中高水平表达。并结合患者的临床特征与预后,分析与染色体组型、预后相关的miRNA。目前已发现miR-148a和miR-20a与患者预后相关,miR-99b、miR-221分别与染色体组型t(4;14)和del(13q)相关。 第三部分miR-148a在多发性骨髓瘤中起癌基因作用 有研究表明多个miRNA分子参与MM的发生发展,在前期的研究中我们发现miR-148a在患者的血浆中升高,并且该分子的高水平与患者较差的预后相关。此外有文献报道该分子在患者骨髓中的肿瘤细胞中表达也升高,然而该分子参与MM发病的机理仍有待研究。 通过转染miR-148a inhibitor,研究miR-148a对多发性骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响,结果发现转染miR-148a inhibitor后,细胞的增殖能力下降而凋亡细胞的比率增高。 我们用Targetscan等软件分析发现在多发性骨髓瘤患者血浆中表达水平升高的miR-148a的靶基因为CDKN1B(P27)和PTEN等抑癌基因。通过荧光素酶报告基因检测证实了miR-148a可与靶基因的3’UTR结合。应用western blot证实miR-148a可抑制靶基因的表达。 本研究初步阐明了miR-148a参与MM病理过程的机理,为多发性骨髓瘤发生、发展的理论及寻找治疗靶点提供新的内容。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R733.3

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