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《第二军医大学》 2000年
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新生隐球菌产黑素野生株与白化突变株酚氧化酶结构基因(CNLAC1)的比较研究

桑红  
【摘要】:新生隐球菌是一种具有荚膜的酵母真菌,能导致全身各脏器的 隐球菌病,但主要侵犯中枢神经系统,其中严重威胁生命的隐球菌 性脑膜脑炎占80%。随着使用免疫抑制剂的增加及艾滋病在全球的 蔓延,新生隐球菌感染率不断上升。对这种酵母菌的潜在毒性因子 的研究近来尤其引人注目。新生隐球菌与其他非致病性的隐球菌不 同,当其在含有二酚化合物的培养基上生长时,在4~48小时内能产 生黑素。产生的黑素为新生隐球菌的一个主要毒性因子。黑素形成 主要是通过抵御免疫细胞释放的氧化剂而发生作用,82年明确膜结 合的酚氧化酶是催化产生黑素的酶类。94年Williamson等率先纯化 了新生隐球菌的这种具有二酚氧化酶活性的酶,并进行了一系列生 化分析,鉴定为漆酶,经纯化后发现此酶为一种75Kda的糖基化蛋 白,去糖基化后为 66Kda,克隆出新生隐球菌漆酶基因 CNLAC1含 一单 ORF(开放阅读框),编码为一含 642个氨基酸的多肽,含 14 个内含子(大小为52~340bp)。 我们对新生隐球菌产黑素野生株和白化突变株进行了比较研 究。首先用多巴培养基CT和咖啡酸玉米吐温二种培养基,从第二 军医大学附属长征医院真菌病研究室128株新生隐球菌中筛选出一 学位论文:新生隐球菌产黑素野生株与白化突受扮酚讽化酶结构丛因(CNLAC)的比较研究 株不产黑素的新生隐球菌白化突变株CCCC10148,选一株产黑素野 生株代表 CCCC10297进行研究。据 CNLAC1的 DNA序列设计合 成了4对寡核苷酸引物,应用PCR分别对产黑素株及白化株进行 DNA扩增。结果发现白化突变株存在约450bp的片段缺失,而野生 产黑素株却无此缺失片段,这为新生隐球菌病的预后、治疗提供了 可能的靶基因。 我们将PCR产物克隆入PGEM丁载体,构建了重组表达质粒, 转化大肠杆菌DH讣,并用测序仪 ABI PAISMTM377PN进行测序。 发现相同条件下产黑素株与白化突变株不但基因长短不同而且序列 也明显不同,这对我们提出了进一步研究的需要,它的成功将为我 们探索隐球菌产黑素的致病机理提供理论依据,同时也为将来对隐 球菌病的基因治疗提供可能。
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