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《第二军医大学》 2000年
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大鼠肝脏糖皮质激素受体的高压液相纯化及测定

张慧  
【摘要】:糖皮质激素(GC)现已广泛用于临床,通过糖皮质激素受体(GR) 介导产生生物效应。GR属于甾体激素受体超家族,主要位于细胞核,具有 高亲和力、低结合容量、高度特异性等特点。而在临床应用中发现应激、 休克、严重感染时常需予大剂量GC冲击治疗,其作用的分子机制尚不完全 清楚。徐仁宝教授[1,2,3]提出,生理剂量皮质激素通过高亲和力糖皮质激 素受体(GR_H)发挥生物效应,而药理剂量的糖皮质激素作用于低亲和力糖 皮质激素受体(GR_L)发挥生物效应。乐颖影[4]等用放射配体法证实了大鼠 肝脏存在低亲和力糖皮质激素受体。但如要最终证实此假说,必须将GR_L作 为实体进行研究。 本研究旨在应用高效液相(HPLC)法,通过对大鼠肝细胞皮质激素受 体的HPLC分析,获得GR的纯化产物,用WESTERN BLOT法进行定性分析, 并探索用 HPLC法进行GR的定量分析。 本研究主要针对糖皮质激素受体的纯化及测定做了以下工作: 1.大鼠肝胞液皮质激素受体的高效液相纯化。 本实验用高效液相疏水作用层析法(HPHIC),Synchropak Propyl层 析柱,反相洗脱程序进行分析。因糖皮质激素受体在组织中含量极微,紫 外检测法敏感度不够,因此我们采用同位素标记,液闪计数法测定。取大 鼠肝胞液,与同位素标记的地塞米松(Dex)结合后,在不同温度及不同配 体浓度条件下进行HPLC分析,分段收集其洗脱液,液闪测定放射性计数。 本研究发现在0-4℃,[~3H]Dex 浓度<50nmol/L时,糖皮质激素受体的洗脱 摘 要.2. 位置在 9叶1分;而在 25C,neX浓度 7 5伽ml八时,在卜7分和卜11 分的洗脱住置均出现洗脱峰,即存在两种可与配体结合的糖皮质激素受体 — —。 2.大鼠肝胞液糖颇激素受体的鉴定。 将敞冷冻离心后的大鼠肝脏细趾清贩肚样,在25C耕下进 行 HPLC纯化,收集 +5分,5--7分,91分,1113 6fi置的毗液,髓 析干膝充分龋,行 S一E k WE删 BloT 定性蛐。SDSWGE锨 3刁分,5刁分的洗脱液均出现多糖白条带,9+1分敝邮于 60Kd出现 咆清晰的条带,而 11《 分洗脱液无明显条带出现。Whsr[EIt:N BLr提示 5- 7分,911分洗脱液于 60Kd处出现阳性条带,6 ys分,11+3分洗脱液允 阳性条带出现。说明5刁分,9l1分肌液中均有可与糖限腿受牌 魏合的受体沂。 3.大鼠肝胞液糖颇激素受体的HPs测定。 传统的测定受体的刎配体法所需样本量大,费用高,且需接触同位 素。本实验试图探索用HPs法测定皿。n WAGE提示9l1分洗脱液仅于 6皿d出现咆清晰的条带,硼删BLOT证实为皿。我们将大鼠撇脓 释成不同贩,在 M℃驸下分别上样行 HPs她,收集 %1分肌 液,Bradford法坝定蛋白瞰,发现 Zth12(ha/L范围内,A595与蛋白跟 线性关系娜。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R580.2;R341

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【参考文献】
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