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《第二军医大学》 2001年
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脑胶质瘤增殖、凋亡及端粒酶反义基因治疗的实验研究

王建奇  
【摘要】: 恶性肿瘤是多因素、多基因的疾病,其共同的特征为:正常细胞周期机制破坏,细胞失控性 生长和过度增殖;从凋亡角度来看,则是细胞的凋亡机制受到抑制,不能正常发挥清除恶变细胞 作用的结果。肿瘤细胞增殖、凋亡失衡状况与病理恶性程度具有明显的相关性,病理恶性程度直 接关系到临床治疗和预后。脑胶质瘤为颅内恶性肿瘤,约占脑肿瘤总数的45%,且生存期短,术 后复发率和死亡率高,根治极其困难。本实验研究尝试一、观察不同恶性级别脑胶质瘤增殖、凋 亡的失衡情况,并建立说明其失衡状态的指标—增殖/凋亡指数(proliferation/apoptosis index P/A Ⅰ),探讨其与胶质瘤恶性程度的关系。二、端粒酶(telomerase)活性在各种人类肿瘤 中总的表达率约85%,为目前已知的最广泛,特异性最高的肿瘤标记物。端粒酶活性的表达是细 胞获得无限制的分裂增殖的特征,端粒酶活性水平与胶质瘤的恶性级别和预后相关。本实验用“反 义基因封条”将端粒酶活性表达抑制,以观察对恶性胶质瘤细胞的抑制作用。三、化疗是脑胶质 瘤治疗不可缺少的重要常规手段,而肿瘤细胞的耐药性又为化疗失败的主要原因,其中,最突出 的为多药耐药(multidrug resistance,MDR)。获得多药耐药性的肿瘤细胞的明显特征为mdr_1过 渡表达了170KD的糖蛋白P-gP,该蛋白位于细胞膜上,作为能量依赖性药物排出泵,将化疗药 从细胞内泵出,使胞内药物浓度降低而出现耐药,其表达程度与抗药性成正比。因此P_(170)糖蛋白 是检测多药耐药的确切指标,对于MDR的抑制可增加肿瘤细胞的化学敏感性,以相对较低的化 疗药物剂量取得较好的疗效。 第一部分脑胶质瘤增殖、凋亡的实验研究及建立增殖/凋亡指数 目的:观察不同恶性级别胶质瘤增殖、凋亡的失衡情况,并建立说明其失衡状态的指标:增 殖/凋亡指数,并探讨其与胶质瘤恶性程度的关系及此指标在胶质瘤实验研究中的应用。方法: 选取脑外伤减压术后的非肿瘤性脑组织8例为对照及不同恶性级别的石蜡包埋的脑胶质瘤标本69 例、手术脑胶质瘤新鲜标本26例分别行HE染色及以增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化法和原位 末端标记法(TUNEL)检测胶质瘤细胞增殖和凋亡状况,经碱性磷酸酶显色和荧光标记,计算机 图像分析系统及流式细胞仪测量PCNA及TUNEL阳性细胞百分率。设定不同阳性细胞百分率范围 分别对应的等级序数,然后,根据每一标本的阳性细胞百分率,计算其相应等级序数之比,既增 殖/凋亡指数(P/A Ⅰ)。P/A Ⅰ数值在0.2~5.0之间。结果:1、PCNA和TUNEL在多数的对照组 脑组织和胶质瘤中均呈阳性表达。随病理级别的增高,PCNA阳性率增加,TUNEL阳性率在各级胶 质瘤中无显著差别。2、平均PCNA阳性细胞率随恶性级别的增高而增加,在对照组及Ⅰ、Ⅱ级和 络二军医人学地0:论义 中 义 摘 嗅 一 Ill、IV级之间存在显耕性差异;平均TUNELm性细胞率随恶性级别增高而有降低趋势,在对照 组与其余各组之间、IV级与其余各织之间均存在显耕羔异。平均 Phl&对照钒,I、11级,Ill、 w级之间存在显肖性差异。3、在所检测的标本中,对照组R人】均在0.2~1.5之间:!、!!级脑 胶质瘤中,85.1%的病例 Ptl小 T 2.5;Ill、IV级胶质瘤中,gi.7%的病例 PIAI在 2.5以上。结 论:防胶质何中纫 殖、凋亡失衡,增殖、凋亡的失衡状况与胶质@的恶性 密切相关;PCNA 和 TIJNEL是标记细 殖、凋亡效为特异、谁确方法;PIA!能较为直观、灵敏的综合反应肿@细 殖、凋亡这两方面的失衡情况,与肿箔恶性级别的差异有更好的相关性,我们认为甲仇!二j 是区分胶质匀相对良性和恶性效为合适的界限。 第二部分 佑胶质@皑粒酶活性的表达及端粒酶反义基因治疗 目的:检测端粒酶活性在脑胶质瘤中的表达,以反义寡核v酸对恶性胶质瘤细胞端粒酶活性 进行反义抑制,观察其对恶性胶质瘤的治疗效果。方法:以德国宝灵曼公司在TMP法基础上改 进的半定量PCR—ELIS^试剂盒检测26例新鲜胚质瘤标本及8例对照钒脑组织中端粒酶活性; 合成15hP的硫代磷酸化反义端粒酶寡核窗酸,检测其稳定性后,以脂质体包裹与Ill、IV&质瘤 体外培养细胞进行孵育,以 PCNA和 TUNEL&光标记后流式细胞仪测挝 PCNA及 T[JNEL则性细胞占 分率,以检测胶质瘤细胞增殖和凋亡状况,计算相应增殖/凋亡抬数。结果:1、硫代磷酸化*DN 在完全细胞培养液中,至少 5 d内是稳定的。观察剑荧光标记硫代磷酸反义 ODN & 2 h后可进入 细胞,4、6 h后胞核内荧光逐渐明显,说明 ODN已进入核区。2、26例胶质瘤标本中,端粒酶 川性22例,总体①!性率为84.6%;8例对照组脑组织均为阴性。端粒酶D!性表达率在对照纽与各 个级别胶质瘤之间以及1、11、皿级和IV级之间差别显耕。3、代表端粒酶活性的平均dA值在各 个级别与对照组之间以及1、11和皿、IV之间差别显肖。平均dA值与平均增殖/凋亡指数成止相 关。4、反义 ODN对端粒酶活性丁 48 h出现抑制作川,了 72 h端粒酶活性
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R73-36

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【参考文献】
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【共引文献】
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