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《第二军医大学》 2001年
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人短蛋白聚糖cDNA的克隆及其mRNA在人脑胶质瘤中表达的研究

韩晞  
【摘要】:胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,其侵袭性生长的特点给手 术彻底切除带来困难,是胶质瘤复发率高、预后不良的重要原因。因此,肿瘤侵 袭生长机制成为近年来胶质瘤的研究方向之一。 以往的研究表明,胶质瘤细胞的侵袭性与细胞外基质密切相关。在神经发育 过程中,神经系统的细胞外基质趋于液态,有利于神经细胞的移动和轴突延伸。 成年后,细胞外基质变得不可溶,细胞的移动受到限制,使脑组织的形态和功能 得以维持。在胶质瘤形成过程中,细胞外基质发生类似神经发育中的改变,脑内 微环境有利于肿瘤细胞的迁移和侵袭。蛋白聚糖作为神经系统细胞外基质的主要 成分,其表达调节与胶质瘤生长密切相关。 短蛋白聚糖(brevican/Brain Enriched HyAluronan Binding,BEHAB,脑富含 的透明质酸结合蛋白)是1994年发现的一种硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG),属于凝集素蛋白聚糖(lectican)家族,是脑内最富 含的细胞外基质分子之一。Brevican存在分泌型和糖基磷脂酰肌醇(glycosyl- phosphatidylinositol,GPI)锚定型两种,由胶质细胞和神经元合成,具有高度的 组织特异性,其表达只限于中枢神经系统,而周围组织中未见表达。brevican的 表达在胚胎晚期开始出现,随神经发育过程而显著增高,成年以后仅维持低水平 的表达。在中枢神经系统损伤时,brevican表达有明显上调。令人感兴趣的是, brevican在脑胶质瘤中也有明显增高。体内外研究提示,brevican在胶质瘤中的表 达需要脑内环境因素,并与胶质瘤侵袭性有关。但是胶质瘤中brevican是否由肿 瘤细胞表达尚无组织学证据,brevican表达量与胶质瘤恶性程度的关系亦未见报 道,brevican在胶质瘤及其侵袭现象中的作用及其机制仍不清楚。 本课题采用RT-PCR方法,从人脑星形细胞瘤中克隆了人分泌型brevican的 全长基因,为进行brevican蛋白表达、抗体制备及生物活性研究建立基础;并且 采用半定量RT-PCR方法结合原位杂交组织学观察,检测了brevican在脑胶质瘤 和非胶质来源脑肿瘤中的表达。 二 中文摘要 二 主要结果: 一、人分泌型 breian cDNA的克隆: 手术中取新鲜脑胶质瘤标本,置液氮中速冻,异硫氰酸肌一步法提取总RNA。 以寡聚dT为引物对polyw“RNA进行逆转录,合成cDNA第一链JCR扩增p-actin 467习24片段,检测逆转录反应的效率。 根据GeneBank的检索结果,设计两对引物:引物EHI/EHZ扩增brevim 48-1637,引物SHI/SHZ扩增br的can 1605-2812。PCR分别得到长约1.6讪的片段 EH-PCR和长约 1.Zkb的片段 SH-PCR。利用两者重叠区中的限制性内切酶 Hnd Ill 位点及引物设计时引入的限制性内切酶EC。RI和Sal位点,将两段PCR产物分 别插人 pBlues吟t SR+质粒的多克隆位点中,经再次酶切、连接,最终得到包含 完整阅读框的 b…an 48毛812。其中有两处点突变:严突变为 C,相应的编码氨 基酸仍为亮氨酸;A’“突变为T,相应的编码氨基酸由谷氨酸变为缀氨酸。 二、brevican M在人脑胶质瘤中的表达: 以地高辛标记的 brevican 1605毛 cRNA探针进行原位杂交。光镜下观察 brevican阳性细胞胞浆呈蓝紫色,大小不一,不均匀散在分布,密度明显大于正 常脑组织,显色适度的细胞中可见略呈浅染的异型细胞核,表明为肿瘤细胞。结 果显示所有23例胶质瘤标本均有明显的阳性反应(100%),其中一例小脑髓母细 胞瘤中可见肿瘤浸润部位呈强阳性反应,而邻近的正常皮层则无阳性细胞:对照 组7例非胶质源性脑肿瘤和脑转移瘤均未见到阳性反应。提示brevican rnRNA是 由胶质瘤细胞表达的,并且具有高度的特异性,这是目前发现的脑肿瘤相关基因 蛋白中特异性最高的。 采用半定量RTPCR方法,以pdctin为内参照检测brevican tnRNA在脑肿瘤 中的表达。结果显示23例胶质瘤中brevican M阳性率为91,3%Q1乃3人 平
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R739.41

【共引文献】
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