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成年大鼠脑内神经干细胞的在体研究

卢洪流  
【摘要】:第一部分 成年大鼠中枢神经干细胞的检测及EGF的体内作用 目的:检测成年大鼠脑内神经干细胞存在部位,及表皮生长因子(EGF)对 神经干细胞增殖的影响。 方法:成年健康雄性SD大鼠45只,体重270~320g,随机分为正常组、脑 室注射EGF组、脑室注射溶剂组,每组15只。正常组不给药,EGF组通过 立体定向单侧侧脑室内微量注射技术给予EGF,浓度为0.1mg/ml,微量泵 控制注射速度为 1μl/min,每次5μl,每日 1次,相当于 EGF 500ng/天,连 续给药7天。溶剂组脑室内注射生理盐水,注射量及方法同EGF组。3组中 各有5只处死前给予5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)注射。BrdU通过腹腔注射 给予,剂量 100mg/Kg,每 2小时 1次共 5次。最后一次给药后 1小时,将 大鼠过量麻醉后以4%多聚甲醛动脉灌注固定,取脑标本,进行病理及免疫 组织化学检查。通过神经干细胞的特异性标记物nestin染色阳性细胞计数, 了解神经干细胞的存在部位及数量,通过BrdU标记指数反映神经干细胞的 增殖情况。 结果:在正常成年大鼠的侧脑室室管膜下层及海马齿状回均发现nestin阳性 细胞,大脑皮层及第皿第IV脑室的室管膜下区未见nestin阳性细胞。双重 免疫组化检查发现部分nestin阳性细胞呈BrdU+双重染色,部分nestin阳 性细胞没有BrdU染色,提示有部分神经干细胞处于相对静止状态。脑室内 给予EGF后nestin阳性细胞明显增加,nestin+ BrdU+双重染色细胞明显 增加(P<0.01)。 结论:成年大鼠侧脑室室管膜下区和海马区存在神经干细胞。这些细胞表达 未成熟细胞的标记物nestin,并有部分细胞不断进行自我更新。脑室内给予 EGF能促进神经干细胞的增殖。 第二部分 脑外伤后成年大鼠神经干细胞的变化及EGF的体内作用 目的:成年大鼠脑外伤后神经干细胞能否代偿性增殖并分化为神经元、神经 胶质细胞,及增殖、分化的调控因素。 方法:成年雄性SD大鼠60只,体重270~3209,随机分为正常对照、外伤、 外伤+EGF 3组,每组20只。外伤组采用大鼠液压脑损伤模型,打击部位为 右侧大脑半球,打击强度 1.5 8UI’-,造成大鼠中度脑损伤。EGF组于伤后第 1 天开始进行脑室内给药,连续给药7天,方法同第一部分。分别在伤后1周 和8周,灌注固定动物(每组各10只),取脑组织标本。每组有5只动物在 灌注前给予BrdU腹腔注射。BrdU给药及灌注固定方法同第一部分。脑标本 进行病理及兔疫组织化学检查。通过检测nsetin阳性及BrdU阳性细胞数了 解神经干细胞在脑外伤后能否增殖,通过不同种类的细胞特异性标记物 NSE、GFAP、nestin分别与BrdU双重染色细胞的计数来观察有没有新生神 经元、神经胶质细胞出现,以了解神经干细胞在外伤后能否进行增殖、分化, 及EGF对增殖分化的影响。各组动物还进行了爬坡实验、行走实验、平衡实 验,以了解外伤后给予EGF对大鼠神经功能的影响。 结果:脑外伤后,损伤区周围及室管膜下区nstin阳性细胞计数较正常组显 著增加。海马区nestin阳性细胞数较正常组无显著增加。给予EGF后,室 管膜下的nestin阳性细胞计数较外伤未给EGF组显著增加o叼01),而损伤 区周围的nstin阳性细胞计数与外伤组无显著差异o>0.05卜双重免疫组化 检查显示:所有组中,伤后早期均有BrdU+nestin+双重染色细胞,8周后发 现BrdU+GFAP+双重染色细胞存在,提示脑外伤后神经干细胞增殖并分化为 胶质细胞;只有在外伤+EGF组的动物发现有BrdU+NSE+双重染色细胞, 提示在EGF作用下,脑内有新生神经元的产生。 虽然给予EGF后能促进成年大鼠脑内新生神经元产生,但爬坡实验、行 走实验、平衡实验等神经行为学检查与外伤未给EGF组无明显差异。提示新 生神经元尚未整合到神经系统中而发挥功能。如何进一步调控神经元的产生 并使新生神经元发挥功能,尚待进一步研究。 结论:1、成年SD大鼠在脑外伤后,神经干细胞能增殖并进行分化,但主要 分化为神经胶质细胞。二、侧脑室内注射EGF能促进大鼠脑外伤后体内神经 干细胞的


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