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《第二军医大学》 2001年
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基于重组酶作用的小鼠ES细胞HPRT基因位点转基因定点整合系统研究

郑敬民  
【摘要】: 转基因小鼠已成为生命科学研究中的一种重要工具。但从方法学上来看,已有的产生转基因小鼠的方法仍存在效率不高、转基因定点整合难的问题。为了方便转基因小鼠的构建和转基因功能的分析,我们设想发展一种高效、定点、单拷贝整合的转基因系统。总的目标是:通过基因打靶和囊胚腔注射育种,构建一个在HPRT基因位点安装有由位点特异性重组酶识别位点等构成的转基因整合靶点的转基因工具小鼠,以该工具小鼠的受精卵作为外源DNA原核显微注射的受体,即可导致注入的外源DNA在重组酶的介导下进行位点特异性整合。 从构建工具小鼠的目标出发,本项研究设计并合成了Flp重组酶识别位点变异体F3RT和Cre重组酶识别位点变异体lox66、lox71寡核苷酸序列;利用这些序列构建了便于外源基因克隆插入的通用型交换质粒pF-Neo-F3和通用型整合质粒pEGFP-lox66和pEGFP-lox71;在此基础上,构建了针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体pSP-HPRT-F-Neo-F3和pSP-HPRT-lox66-Neo。并用电穿孔法分别将两打靶载体DNA导入R1 ES细胞,经G418和6-TG筛选和分子鉴定,得到了2个发生了预期双交换的重组ES细胞克隆。 利用获得的重组ES细胞、构建成的交换质粒pF-HPRT-F3及Flp表达载体pCMV-Flp和pEF-Flp,本研究进行了Flp重组酶介导的盒式交换试验。经电穿孔法基因转染、HAT选择性培养基筛选、G418药物敏感性试验以及基因组Southern杂交分析,发现得到的48个HAT抗性ES细胞克隆中有6个克隆发生了预期的盒式交换重组。这一结果表明,利用Flp重组酶介导的盒式交换在小鼠基因组的HPRT位点进行转基因的定点整合至少在ES细胞水平上是可行的。以上研究为进一步构建转基因工具小鼠,建立基于重组酶的高效、定点转基因体系打下了基础。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q78

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