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《第二军医大学》 2001年
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竞争PCR联合产物酶联杂交技术的改良及氧化苦参碱抗病毒机理的研究

徐文胜  
【摘要】: 大量临床和基础研究证实,氧化苦参碱(OM)具有良好的抗乙 型肝炎病毒效果,有着很好的临床应用前景。然而目前的研究尚不 够系统深入,不能完全阐明其抗病毒机理。此外,如何评价某种药 物抗病毒效果,病人在抗病毒治疗后反应性如何,除肝组织病理检 查外,HBV DNA定量检测无疑是判断抗病毒药物治疗效果中最直接、 最可靠和最有价值的指标。 目的:建立等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量检测HBV DNA技术(PCR-ELISA法),并将之应用于氧化苦参碱的体内外抗病 毒作用机理的研究中,以进一步探讨氧化苦参碱对乙型肝炎的治疗 作用。 方法:1.建立等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量检测HBV DNA技术(PCR-ELISA法)。采用突变引物法,以野生HBV为模板, 经一步PCR扩增出突变片段,并克隆入pTadv质粒,制备成完全等 效的竞争PCR内参照。通过竞争PCR将内参照与野生HBV一同扩增, 应用微反应板酶联杂交技术对PCR产物作定量分析。2.以转染HBV 基因的HepG2.2.15细胞株为研究对象,无环鸟苷作为阳性对照, 观察氧化苦参碱不同浓度、不同作用时间对细胞培养上清中HBV DNA 水平的影响。计算氧化苦参碱对细胞分泌HBV DNA的抑制率,以综 一 合评价氧化苦棚的体外抗IIBV龈,并进一步探讨其抗乙肝病毒 机理。 靴:1.我们建立的等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量 检测HBV DNA技术(PCRELISA法)具有以下优点:第一,制备方 法的优势:在目的片段上龈理想的扩增区域,并设计合适的突变 引物,将突变引物与另一根配对引物及目的基因一起作一轮PCR即 可获得突变片段,与目前所有报道方法相比,这种方法最简单、方 便、易行。第H,完全等效扩增:突变片段的长度和A、T、C、G 组成均与野生片段完铡凤 因此可以保证两种模板在PCR过程中 等效扩增,提高了定量狐的精确度。第三,为竞争PCR产物的杂 交检测饿了最佳条件:突变片段的突变序列,是突变片段特异的; 杂交位点,而且这个杂交位点的所有杂交驰均与拟扩增的目的片 段的相对应部棚同,因此可在此剜墒立竞争PCR产物的酶联 杂交定量分析方法。与人工化学合成等长DNA内参照相比,在应用 原理方面有相同的特点,即既能保证与野生片段等效扩增,又可在 杂交检测溅中与野生片段区分,但在制备方法上则比之更简单、 易行和经济。第四,特异性强,灵鹏高(可达 10fg加l),稳定 性佳。2.栅究观察了不同浓度氧化苦翱对 HepGZ.2.15细胞表 达 HBy DNA的抑制效果,结果表明,随着浓度升高,OM抑制 HepGZ.2.15细胞分泌IIBV DNA的作用逐鹏强。当OM为1000pg/ml 时,其抑制率最高,达79.6巩但是,再提高删浓度,可能由于 药物毒性作用,细胞死亡增加,导致大量的病毒由死亡的细胞中释 出,影响检测结果。我们的研究瞰现,保持药物在培养上清中的 浓度是保证药物抑制率的关键。相同浓度的药物在作用第一个24 /J’时、第二个24小时、第三个24小时,它的抑制率相似。但若延 长作用时间,即连续培养 48或 72小时,药物抑制细胞分泌 HBV DNA .。_._,、w-m----x*************、、,、——._—__._、.、,。,,。,_—_——_.__ 中文摘要 能力明显眺.由于细胞的自然新陈代谢,细胞死亡后,病毒从细 胞内释放。我们的实验结果尚不能揭示删连续作用与 HePGZ.2.15 细胞分泌删加A之问的关系:删作用第九天,所测得H矾mA 量几与空白对照相同。 蛐:1.我们建立的等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定 跳测HBy DNA技术(KWISA法)敏感、稳定、特异性好,并 且能最大地满足竞争PCR的等效性。有极好临床应用前景。z氧化 苦纲能在HBV复制水平抑制病毒的合成,但其究竟作用于病毒复 制雌的哪一环节,或是否对病毒转录、翻译及分泌能力亦具有干 扰作用,有待进一步研究证实。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R512.62;R965

【参考文献】
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