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《第二军医大学》 2001年
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体外诱导胚胎干细胞为神经细胞模型的建立及相关因子的实验研究

蔡斌  
【摘要】: 中枢神经系统损伤修复一直是困扰科学家的重要难题,主要的原 因是损伤的神经元不再具有恢复正常突触连接的能力,目前认为损伤 不是一个突发的过程,而是渐进的,包括神经退变和细胞的死亡。因 而在大多数的中枢神经创伤和疾病中,由于神经元和胶质细胞的死 亡,残存的神经细胞不能恢复机体的功能,因而采取外源细胞替代的 方法是一种至关重要的步骤。其中一个极好的例子是颈脊髓损伤后运 动神经元丧失功能,无论采取桥接或是重置神经质配,损伤神经元支 配肌肉的功能不能恢复。正是认识到细胞替代的重要性,目前一些实 验室采用胎儿的组织移植来取代损伤的细胞,这些工作有的已经应用 于临床,但是由于其内在的机制以及伦理和胎儿组织的有限而受到限 制。理想的细胞替代物该是同源的、并易获得。 干细胞作为一种给损伤的中枢神经系统提供新的神经元和胶质 细胞的细胞源具有良好的前景。胚胎干细胞来源于发育的囊胚的内细 胞群,体外可以大量增殖,重新置入体内仍然可以继续分化形成各系 的细胞,包括生殖系的细胞。它先形成具有三维结构的拟胚体,在分 化形成各种细胞。体外建立胚胎干细胞诱导神经细胞的模型是进一步 对中枢神经系统损伤进行细胞治疗的基础。本课题是第一部分利用 RA诱导胚胎干细胞向神经细胞分化,其次是GFPcDNA转染胚胎干 细胞,使胚胎干细胞具有标记。 我们首先原代培养成纤维细胞,在经丝裂霉素C处理后成为胚 胎干细胞的滋养层细胞,胚胎干细胞可以在其上生长和增殖,将生长 第二军医大学颀士学位怆文 骨对学专业 状态良好的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化,依据与成纤维细胞的贴壁时 间的不同而分离,转移到己加入RA的没粘附底物的细菌培养M形成 -拟胚体,诱导4天后再经胰蛋白酶消化后种植到粘附性的培养M上, 诱导46天后,开始有神经样细胞的出现,用免疫组织化学中的ABC 法来鉴定诱导后不同时间的神经样细胞的类别,时间的顺序分别是神 经前体细胞,神经原和神经胶质细胞,并用抗GAD和GABA的抗体 来确定诱导的神经元有功能。在第H部分我们将质粒DNA在大肠杆 菌中大量扩增后,利用试剂盒提取,脂质体转染法转染胚胎干细胞, 并经G418筛选,荧光显微镜下关观察有绿色荧光。 总结,胚胎干细胞在体外经RA的诱导能高效的产生不同类别 的神经细胞,同时成功地使胚胎干细胞表达绿色荧光蛋白,是胚胎干 细胞具有标记蛋白,为下一步的工作奠定了基础。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R329.2

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