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《第二军医大学》 2002年
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抗人肝癌标志物MXR7单克隆抗体的制备与临床应用研究

吴秀菊  
【摘要】: 原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),简称肝癌,是恶性肿瘤中对人体造成严重威胁,死亡率很高的疾病。目前,就世界范围而言,其发病率呈上升趋势,手术切除仍是主要的治疗手段。作为一种高死亡率的疾病,肝癌的病因、发生发展、复发、转移以及诊断和治疗都越来越引起人们的关注。其中,肝癌的早期诊断是提高总体疗效的关键,同时对于患者的转归以及预后都具有十分重要的意义[1-6]。在肿瘤的临床研究和实践中,早期发现、早期诊断、早期治疗是延长病人生存期的关键。肿瘤标志物(Tumor marker,TM)在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的临床实用价值[7-9]。自80年代以来,随着应用B淋巴细胞杂交瘤制备肿瘤单克隆抗体技术的不断成熟,出现了大量抗肿瘤的单克隆抗体,并与同时出现且日新月异的免疫学检测技术(RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA等)相结合,发展了众多的肿瘤标志物检测项目并不断地结合应用于临床,已成为肿瘤普查、早诊和随访的一个重要检查指标。 MXR7基因是1995年Lage等人通过差异杂交方法从抗米托蒽醌的人胃癌细胞系分离克隆的[10]。随后,我们在研究肝癌特异性敏感标志基因时,从肝癌cDNA文库分离得到MXR7基因。该基因全长cDNA序列为2263bp,定位于人染色体Xq26,由8个外显子组成,编码由580个氨基酸组成的硫酸肝素类蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycans,HSPG),分子量66 kDa,通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)锚连接于细胞膜,属于蛋白聚糖家族。该基因大量表达于胎盘以及胎儿肝脏、肺脏和肾脏,被认为参与发育期形态发生和生长调控。我们的研究与文献报道均表明,MXR7与肝癌的发生发展有密切关系。另外,由于MXR7在肝癌的恶性进展中的表达水平逐渐增高,使之可能成为用于判断肝癌的预后或抗肝癌转移和复发的重要的靶基因。因此,MXR7基因已成为一个潜在的具有重要临床应用价值的新的肝癌标志物[11-13]。 本研究的第一部分,是抗原纯化。我们从人胎盘cDNA中克隆了5'端缺失 WP=6 171bp的该基因片段(1569bp),利用原核表达系统,成功地诱导表达了MXR7 蛋白C端523个氨基酸,6个组氨酸的引入使我们纯化得到了目的蛋白,获得了较理想的免疫原,为下一步制备单克隆抗体奠定了基础。 研究的第二部分,是单克隆抗体的制备和鉴定。我们用了近一年的时间,经过免疫小鼠、细胞融合、杂交瘤的鉴定、杂交瘤细胞的克隆化等多步实验,最终获得了6株稳定的能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系,即F4C4、B5B8、D8G6、C2C2、C6C5和C9C3。通过鉴定证实我们所获得的单克隆抗体效价高,各个单克隆抗体经MXR7吸收前后的OD值分析及与人血白蛋白、人血丙种球蛋白反应分析均证明获得的单克隆抗体特异性好,蛋白印迹杂交(Western blot)实验中,不论是原核细胞总蛋白,还是肝癌细胞系的细胞总蛋白裂解液,单克隆抗体均与所针对的目的蛋白特异性结合。用单抗对肝细胞癌组织切片进行免疫组化染色,结果显示在肿瘤包膜区进展性癌巢的癌细胞胞浆中着色明显,这一结果既证实单抗特异性好,也提示它可用于肝细胞癌的组织学诊断。最关键的是,我们在国际上首次获得了抗MXR7的单克隆抗体,为进一步研究其在临床肝癌早期诊断和判断预后上的意义以及对MXR7的生物学特性进行深入研究奠定了基础。 研究的第三部分,是临床应用检测。于我院检验科收集肝癌患者血清109例,同时收集非肝癌肝胆疾病患者血清43例。于长海医院血库收集正常人血清50例,采用竞争ELISA方法检测这些血清中的MXR7蛋白。结果109例肝癌患者血清MXR7检测OD值的平均值为0.096,而43例非肝癌肝胆疾病患者血清MXR7检测OD值的平均值为0.115,50例正常人血清MXR7检测OD值的平均值也为0.115。采用方差分析进行统计学处理,结论是:肝癌患者与正常人比较,血清MXR7 OD值差异显著(p0.01);肝癌患者与非肝癌肝胆疾病患者比较,血清MXR7 OD值差异显著(p0.01);而非肝癌肝胆疾病患者与正常人比较,血清MXR7 OD值无显著性差异(p0.05)。即肝癌患者血清MXR7的浓度明显高于正常人及非肝癌肝胆疾病患者,这一结果为将单克隆抗体应用于临床原发性肝癌的血清学诊断提供了实验依据。另外,23例AFP阴性肝癌病人血清MXR7 平均OD值为0.099,明显低于正常人与非肝癌肝胆疾病患者,说明检测血清MXR7 WP=7 有助于AFP阴性肝癌病人的诊断。18例术后复发的肝癌病人血清MXR7 平均OD值为0.092,明显低于正常人与非肝癌肝胆疾病患者,即肝癌术后复发的病人血清MXR7浓度明显增高,提示监测血清MXR7有助于判断肝癌患者的预后、转归。 本研究中,我们不仅成功地获得了抗MXR7的单克隆抗体,而且已初步将之应用于原发性肝细胞癌的血清学诊断,特别是对AFP阴性肝癌的鉴别诊断和判断肝癌病人的预后极有意义。我们的工作为探索肝癌早期的血清学诊断提供了新的实验依据,并为进一步以肝癌标志物MXR7为靶,探索其在肝癌的免疫治疗方面可能发挥的作用奠定了基础。这些研究成果已向中华人民共和国国家知识产权局申请了专利(申请号:01131940.2)。同时,我们所获
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R392

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