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人树突状细胞来源的新分子Siglec-10和人骨髓基质细胞来源的新分子PHDP的克隆与功能研究

李楠  
【摘要】: 人类基因组计划是人类科学史和生命科学领域的跨世纪重大工程,旨在阐明人类基因组全部碱基对的序列,发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类全部遗传信息,从而揭示生命的奥秘和疾病的发生发展规律,最终探索出防治疾病的方法。随着对生命密码的破译进入尾声,一个以功能基因组、蛋白质组和药物基因组为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕,并将对我国基因组研究提出更为严峻的挑战。 树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一种重要的专职抗原提呈细胞(APC),具有刺激初始型T细胞增殖、启动初次免疫应答的独特功能,是T细胞免疫应答的直接启动者和调控者。骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BMSC)是造血微环境的重要组成部分,它不仅为造血干细胞的生长提供附着场所,而且还通过与造血干细胞的直接接触和分泌多种生长因子,调节和影响造血干细胞和免疫前体细胞的成熟和分化。因此,从DC和BMSC中寻找新型免疫分子将有助于深入认识DC和BMSC的生物学和免疫学功能,阐明其作用的分子机理,获得参与其功能有关分子的重要信息,从而从分子和基因水平上对二者独特的功能作用机制有更深入和全面的了解。本文所研究的Siglec-10和PHDP就是通过对DC和BMSC cDNA文库进行大规模随机测序获得的两种新分子。 一、 来源于人树突状细胞的新型唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素Siglec-10的克隆与生物学功能研究 Siglecs(Sialic acid-binding Ig-like lectins,唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素)是一个隶属于免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily, IgSF)的凝集素家族,其成员可通过特异性识别糖蛋白和糖脂的糖基侧链上的唾液酸来介导蛋白质-碳水化合物的相互作用。 WP=6 经大规模随机测序和同源比较,我们从人树突状细胞cDNA文库中分离到一个新EST(SBBI91),其全长cDNA为3124 bp,编码602氨基酸的蛋白。该蛋白在核酸和氨基酸水平上与人唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族(Siglec)成员表现高度同源。由于Siglec家族当时已经报道的成员为Siglec-1至Siglec-9,根据该家族的命名法,将我们发现的这一全长新基因命名为Siglec-10。该基因已经在GenBank登录(登录号为AF311905),并申请国家发明专利(专利申请号为01105501.4)。 Siglec-10在氨基酸一级结构水平上与Siglec家族成员Siglec-5最为相似,全序列的相似性为51%,一致性为38%。Siglec-10分子具有Siglec家族成员的多种结构特征。其蛋白包含胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由16个氨基酸的疏水信号肽和4个免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain)组成,其中包括1个V-set结构域和三个C2-set结构域;跨膜区由28个氨基酸组成,后接123个氨基酸的胞浆尾巴。Siglec-10与其它家族成员同属免疫球蛋白超家族(IgSF)。Siglec-10蛋白N-端Ig样结构域中具有其家族高度保守的半胱氨酸分布模式,典型的精氨酸(Arg119)及两个芳香族氨基酸(Phe21和Phe130)分布,和胞外区保守的糖基化位点等;其C-端的胞浆区基序具有保守的酪氨酸(Tyr)分布,其中有两个位于“基于酪氨酸的免疫受体抑制性基序”(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)中。Siglec-10 基因的染色体定位在19号染色体19q13.3区域,与家族成员Siglec-3,-5,-6,-7,-8 和-9等成簇分布在染色体19q13.3-13.4 区域。对整个Siglec家族进行系统进化分析结果显示,Siglec-10与Siglec-3/CD33、Siglec-6和Siglec-5的关联最近。因此在进化上Siglec家族成员可能是从同一祖先基因经多重基因复制而进化来的。 RT-PCR分析结果证实Siglec-10 mRNA在DC中存在一种时间依赖性的表达模式。Siglec-10在来源于正常人外周血单核细胞的DC中有较强表达,经LPS活化后表达水平有所下降,至24小时达到最低水平,随后表达增加,至LPS刺激48小时后重新达到较高水平。Siglec-10在造血细胞系和实体肿瘤细胞系中也具有广泛的表达。对白血病细胞系经LPS或PMA刺激后发现,HL-60和U-937细胞经PMA刺激后Siglec-10的表达有下降的趋势,而本来不表达Siglec-10的K-562细胞经LPS或PMA作用后Siglec-10表达增加后又有所降低。Northern杂交结果显示Siglec-10有3.3 kb和1.8 kb两种转录形式,其中3.3 kb的条带在外周血白细胞、卵巢和脾脏中表 WP=7 达较强表达,在肝脏中表达较弱,而在其它组织中未见表达。1.8 kb的条带表达更为广泛,如正常人的心脏、肺、肝脏、骨骼肌、脾脏、胸腺、卵巢和小肠等组织,其中在肺、肝脏、脾脏、胸腺中表达水平较高。存在两种转录本表达的组织为肝脏、脾脏、卵巢,其中肝脏和脾脏中1.8 kb条带表达占优,而卵巢中则以3.3 kb条带为主。利用pNGFP载体构建了Siglec-10完整编码区C端与绿色荧光蛋白(GFP)融合的真核表达载体,并在COS-7细胞中进行了瞬时表达,进行Siglec-10的亚细胞定位研究。Confocal显微镜分析显示,Siglec-10荧光信号平均分布于细胞膜表面。这一结果与Siglec家族的结构特征以及通过软件进行的Siglec-10蛋白结构区域预测结果完全一致。 利用pcDNA3.1/His-Myc(-)B载体构建了Siglec-10完整编码区C端与myc表位及6His融合的真核表达载体,并在COS-7细


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