收藏本站
《第二军医大学》 2002年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基因工程制备重组人胰高血糖素样肽-1及其生物学活性研究

张志珍  
【摘要】: 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1))是人体进餐、口服或静脉注射葡萄糖后肠道细胞分泌的一种能引起胰岛素分泌的生理性肽类激素,在体内有多种存在形式。自从80年代被发现以来,通过大量的人体和动物实验已证实,给予外源性的GLP-1时能有效地对胰岛素的分泌、胰高血糖素的分泌、胰岛素原的合成、胃的排空、饮食习惯和非胰岛素依赖的葡萄糖摄取等方面产生影响,是目前公认的体内重要的活性降糖肽,因而对糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病(NIDDM)的治疗具有广泛的应用前景。本课题的研究,主要涉及人源性GLP-1(human GLP-1,hGLP-1)cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化,并探索纯化获得的重组hGLP-1(recombinant hGLP-1,rhGLP-1)的生物学活性。由于采用基因工程方法制备rhGLP-1和针对重组GLP-1生物活性的研究尚未见国内外文献报道,因此本研究结果不仅可为产业化规模制备提供技术线路,而且也可为开发rhGLP-1的临床应用提供资料。 课题研究的主要内容包括:(1)hGLP-1cDNA的克隆、表达载体和工程菌株的构建;(2)hGLP-1工程菌的高密度发酵和诱导表达;(3)rhGLP-1及其前体prerhGLP-1(precursor of rhGLP-1)的分离纯化;(4)prerhGLP-1的体外酰胺化修饰;(5)建立动物模型和测定rhGLP-1体内生物学活性。 考虑到hGLP-1在体内主要以hGLP-1(7-36)NH_2和hGLP-1(7-37)两种活性形式存在,本课题分别研究了该两种rhGLP-1的基因工程制备过程及各自在体内的生物学活性。 方法:1.分别合成6个prehGLP-1(7-36)NH_2 cDNA和hGLP-1(7-37)cDNA寡核苷酸片段,用改进的小片段拼接技术,拼接成完整的prehGLP-1(7-36)NH_2cDNA和hGLP-1(7-37)cDNA,构建重组质粒pGEX-prehGLP-1和pGEX-hGLP-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得高表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pGEX-hGLP-1和BL21(DE3)/pGEX-prehGLP-1。2.摸索合适的诱导表达条件,采用分批培养和补料分批培养相结合的方法,用5L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养以大量产 厂l伦又 砰呵}”W刀】W人馒凸闪闭可w肚一D L抖’二刃’】仍IW闪沁 生融合蛋白OST寸hGLP、人3.高密度发酵培养的菌体超声破碎后,裂解液用 Glutathione Sepharose 4B亲牙层析纯化收集GST融合蛋白,经CNBr裂解、QAE Seonarose FF 柱层析和 RP-C*柱脱盐,收集 prerhGLP-1(7-36)NH和 rhGLP-l(7-37)。4.CPD-Y催化体夕转肽反应,对 prerhGLP-1(7-36)NH C末端 进行酚胺化修饰。5.大鼠体内降糖活性测定。正常SD大鼠用葡萄糖* 八gAity 处理后,在很短时间内血清葡萄糖浓度迅速升高,此时腹腔分别给予一定剂量研_ 究制备的两种rhGLP刁作为供试品,对其降血糖活性进行比较和分析。同时使用 1型糖尿病大鼠模型对其生物学活性进行研究。 结果与讨论:1.构建的两种重组质粒转化大肠杆菌 BLZI①E3L 挑取单克 隆摇菌,用 BamH、Xho双酶切和 DNA序列测定对重组质粒进行鉴定,筛选出 了具有prehGLP-l(7-36)NH。cDNA和 hGLP-l(7-37)cDNA片段正向插入且与 GST_ 之间读码框架正确的PGEX叶T0的重组质粒。IPTG诱导4h后,出现明显的诱导_ 蛋白条带,表达量占茵体总蛋白量的30%~40%。2.采用分批培养和补料分批 培养相结合的技术,控制碳源和氮源的补加,控制溶解氧的量,可使重组工程菌 发酵0.D6。。值达52,发酵菌体内融合蛋白占菌体总蛋白量的28儿融合蛋白总产 。量达到每升发酵液2。ig。3·上述发酵工程菌超声破碎、01u(。m士neup他r。s”- 4B 亲和 纯化后,GST-prerhGLP-l(7-36)NH。融合蛋白纯度大于90%, GST-rhGLP-l(7-37)融合蛋白纯度也在90%以上。两种融合蛋白经CNBr裂解、阴 离子交换柱层析、RP{;。柱脱盐,收集液用HPLC进行纯化和分析,各自的主峰_ 纯度大于85儿ESIMS鉴定分子量与理论值相符合。表明上述纯化过程己得到了-- prerhGLP一l(7一36)NH和 rhGLP一l(7一37)。4.利用 CPD--Y催化体夕转酞胺化一 应,成功实现了对PrerhGLPl*刁6)NHz的C末端酚胺化修饰。每隔0.sh取样- 分析发现,反应在Zh达到峰值,产率大于50%,反应时间延长产率反而下降。 反应产物用 HPLC进行纯化,ESI--MS测定分子量为 3297.5,与理论计算的分子量 ,相符,证明酚胺化修饰后得到了与天然rhGLP-l(7-36)NH一级结构相一致的产 物。5.采用正常SD大鼠和 1型糖尿病大鼠模型对不同剂量的rhGLP-1体内生 物学活性进行研究。动物实验结果表明:腹腔注射不同剂量的rhGLP叶*《6)bJHHr- 和rhGLP、*七7),除低剂量外均具有显著和非常显著的促胰岛素分泌和降血糖 活性;两种rhGLPl促胰岛
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 倪辉;洪清林;肖安风;李利君;蔡慧农;苏文金;;一株法夫酵母虾青素高产菌株的生产性能[J];生物工程学报;2011年07期
2 程涛;杨建明;刘辉;张英伟;宋秋华;咸漠;;拟南芥硫酯酶基因(atfata)在大肠杆菌中的表达及其对游离脂肪酸合成的影响[J];应用与环境生物学报;2011年04期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王杰鹏;刘沛溢;韩晋军;李晓楠;谭天伟;;高密度发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸发酵条件的优化[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
2 崔莉;谭树华;吴梧桐;;重组水蛭素Ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年
3 宋留君;孔毅;周长林;;高密度发酵的影响因素[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
4 陆庆泉;沈志强;刘吉山;柴家前;;鸡致病性大肠杆菌高密度发酵条件优化的研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
5 米云飞;王秀丽;陆玲;;注射用重组人α-2a干扰素治疗尖锐湿疣疗效观察[A];第一届全国中西医结合男科学术会议论文汇编[C];2001年
6 刘佃辛;张符光;顾景范;;重组人胸腺素α原对衰老和缺锌免疫功能的影响[A];中国营养学会第四届老年营养学术会议论文摘要汇编[C];1999年
7 张瑞军;田志刚;魏海明;孙汭;刘金生;王郡甫;王增鑫;张捷;;重组人白细胞介素-18的高效表达、初步纯化及其生物学活性研究[A];第七届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2001年
8 桑景华;黄正南;曹采苹;;重组人淋巴毒素LT28-171大鼠胚胎毒致畸试验的研究[A];中国药理学会制药工业专业委员会第十一届学术会议论文摘要汇编[C];2004年
9 毛华;陈松森;狄旭;贾佩臣;梁植权;;重组人SCF-GM-CSF融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
10 张瑞军;田志刚;魏海明;孙汭;冯进波;赵跃然;张捷;;重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 蒋明;重组人白细胞介素-12上临床[N];健康报;2003年
2 东辰;二医大研制出抗癌类新药“重组人新型肿瘤坏死因子”[N];中国高新技术产业导报;2001年
3 天明;国家一类新药——重组人血管内皮抑制剂YH-16进入临床试验[N];中国高新技术产业导报;2001年
4 本报记者 谭勇 洪天语;速度与观念“双赢”[N];医药经济报;2004年
5 胡左;高密度发酵技术助益生菌产业化[N];中国食品质量报;2010年
6 本报记者 庄少文;海王生物 进军流感疫苗领域[N];证券日报;2005年
7 ;重组人活化蛋白C为脓毒症治疗带来希望[N];中国医药报;2003年
8 月荣;重组人促甲状腺素可取代左旋甲状腺素抑制治疗[N];中国高新技术产业导报;2001年
9 记者 陆旭升通讯员 朱婵;我市14个项目列入省级农业科技成果转化资金项目[N];金华日报;2008年
10 ;重组人VEGF基因治疗大鼠缺血TRAM皮瓣的观察[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张志珍;基因工程制备重组人胰高血糖素样肽-1及其生物学活性研究[D];第二军医大学;2002年
2 田海山;重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)高密度发酵、纯化及其工程化研究[D];吉林农业大学;2011年
3 迟雷;基于过程控制优化的重组大肠杆菌高密度发酵研究[D];西北大学;2011年
4 申烨华;重组人γ-干扰素生产工艺优化及α-糜蛋白酶复性研究[D];西北大学;2001年
5 郑大勇;完全人源化基因工程抗体anti-HBsAg Fab原核体系表达纯化工艺路线放大可行性研究[D];第一军医大学;2004年
6 朱剑昆;重组人白细胞介素-11的表达及其与多种细胞因子在小鼠急性放射损伤中的研究[D];苏州大学;2001年
7 任晓冬;重组嗜热酯酶工程菌的发酵工程研究[D];吉林大学;2005年
8 丘玉昌;重组人肝细胞生长因子的真核表达及对小鼠实验性肝纤维化的治疗作用[D];第一军医大学;2001年
9 马晓轩;基因重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其分离纯化[D];西北大学;2006年
10 高瑞娟;强化融合蛋白Fv-LDP-AE体外活性研究及产生融合蛋白Fv-LDP的重组菌E.coli BL21(DE3)Star~(TM)/pEFL高密度发酵[D];中国协和医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘道洁;基因工程下游标准化体系工艺技术研究[D];山西医科大学;2003年
2 王海波;重组人粒细胞集落刺激因子生产工艺的研究[D];西北大学;2002年
3 李世军;重组人干扰素α2a直肠栓剂的研究[D];吉林大学;2004年
4 蒋祖军;rhIL-11动员小鼠外周血造血干/祖细胞的实验研究[D];第一军医大学;2002年
5 魏玮;重组大肠杆菌高密度发酵生产Ⅵ型胶原蛋白的工艺研究[D];吉林农业大学;2012年
6 苑隆国;重组人血清白蛋白的纯化工艺研究[D];沈阳药科大学;2001年
7 陈超;重组大肠杆菌高密度发酵过程建模与控制[D];大连理工大学;2010年
8 董鲁;重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达及高密度培养的研究[D];暨南大学;2003年
9 刘述江;重组人红细胞生成素治疗妇科贫血的初步研究[D];四川大学;2003年
10 李翔;重组人干扰素-γ生产工艺的重大改进[D];西北大学;2002年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978