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《第二军医大学》 2002年
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小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与结构分析及ZNF191转基因小鼠和ZF-12基因剔除嵌合体小鼠的建立

厉建中  
【摘要】: 人类锌指蛋白ZNF191为类Krüppel转录因子,能与酪氨酸羟化酶基因(tyrosine hydroxylase gene ,TH)上的TCAT重复序列特异结合。TH基因编码儿茶酚胺(catecholamine) 合成的限速酶,暗示ZNF191可能参与调控儿茶酚胺的合成。在患神经精神病和心血管疾病的患者中发现儿茶酚胺能(catecholaminergic)传递失调,暗示ZNF191基因可能是这些疾病的发生或发展的相关基因。另外,ZNF191在肝组织中高表达,且在肝癌组织中表达明显上调,暗示其表达与肝癌发生或发展相关。大鼠的研究暗示其同源基因ZF-12可能参与大脑发育的调控;小鼠的研究暗示ZF-12可能与软骨分化相关。我们试通过ZNF191转基因小鼠和ZF-12基因剔除小鼠模型探讨该基因的生理功能。 我们首先以人锌指蛋白基因ZNF191的cDNA为探针,筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,意外地首次获得了一个与ZF-12基因相关的无内含子的假基因序列, 以ZF12p(ZF-12 pseudogene)命名在GenBank登录(AY040222)。多种组织的RT-PCR和启动子序列分析,暗示该基因不表达,且无内含子,与ZF-12高度相似。查寻GenBank的人类基因组库以及基因组Southern杂交结果显示人类基因组中无ZNF191假基因序列。另外,以ZF-12假基因的Hind III片段为探针,筛选小鼠基因组文库,首次获得了小鼠锌指蛋白ZF-12基因组全序列,并在 WP=5 GenBank登录(AY052495)。序列分析表明:该基因含有4个外显子和3个内含子,内含子都遵循GT/AG的剪接模式;第91密码子处存在单核苷酸多态性;可能存在2种大小不同的3'端的非翻译区(3'-UTR);与小鼠锌指蛋白基因Zfp-35相连锁,将其定位于18号染色体的B3-C带上或附近;5'端上游存在1个约250 bp 高度富含GC的启动子序列。ZF-12基因的5'端系列缺失荧光素基因报告载体的瞬时转染实验表明,其上游序列(-762 - +70)具有启动子转录活性,且在-824 - -762序列上可能存在的负调控元件。 利用小鼠锌指蛋白ZF-12基因组DNA片段,构建了3个针对小鼠ZF-12基因位点的替换型打靶载体。将其中同源臂最长的打靶载体pSSC-TV-10.5进行了ES细胞打靶,共挑取508个G418/GANC双药抗性克隆,经PCR和基因组Southern杂交鉴定,获得4个ZF-12+/-基因的ES细胞杂合子克隆。 进行了ZF-12+/-杂合子ES细胞囊胚腔显微注射,获得了4只嵌合体小鼠(3只雄性,1只为雌性),其中1只雄性小鼠毛色嵌合率约50%,其余3只毛色嵌合率约30%。 原核显微注射了582个受精卵,产下81只小鼠,获得了4只PCR和基因组Southern杂交阳性的ZNF191转基因小鼠。这些研究为进一步阐明ZNF191或ZF-12的生理功能创造了必要的条件。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q78

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