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《第二军医大学》 2002年
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一个新的膜联蛋白亚家族—AnxB1的鉴定及其抗凝血功能的研究

颜宏利  
【摘要】: cC1是孙树汉教授利用免疫筛选的方法,从猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)cDNA文库中分离到的一个抗原基因。大量的研究证明,cC1不仅是一个重要的保护性抗原,而且可能参与了囊尾蚴细胞丝裂原信号传导途径,对于细胞的生长、分化具有重要的生理意义。为进一步探讨cC1的生理功能,首先利用生物信息学(bioinformatics)软件对cC1进行了序列分析、二、三级结构预测和基本理化特性预测。通过核酸水平和氨基酸水平的相似性搜索,发现cC1同膜联蛋白家族(Annexin family)成员的序列相似性达到了40~60%。一般认为,当两个基因的序列相似性大于30%,那么这两个基因就可能是同源基因。因此,cC1可能同Annexin基因同源;进一步利用多个蛋白质结构域数据库进行分析,发现cC1氨基酸序列中具有四个典型的Annexin重复区域。每个重复区域由70~100个氨基酸残基组成,包含一个"M-K/R-G-X-G-T-(38residues)-D/E”的基序;对cC1的二级结构进行预测,发现该蛋白以α-螺旋为主,占氨基酸总数的57.8%。基本没有β-折叠出现;利用同源建模(homology modeling)预测cC1的三级结构,发现cC1同Annexin A5具有相似的拓扑结构。这些预测和分析均表明,cC1具有Annexin蛋白典型的结构特征,因此很可能是Annexin家族的一个新成员。 Annexin家族是在真核生物中广泛存在、具有重要生理功能的一类钙结合蛋白。因其在Ca~(2+)存在的情况下能够和酸性磷脂结合,所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白(calcium-dependent phospholipid binding proteins)。将cC1编码序列克隆到原核表达载体pGEX-5T中,转化大肠杆菌k802,在IPTG诱导下表达,得到GST融合蛋白。利用磷脂共沉淀法证明该融合蛋白在2mMCa~(2+)浓度时,能够和含磷脂酰丝氨酸的脂质体结合,而且这种结合是可逆性的,加入钙离子螯合剂EGTA后能够和膜分离。以上结果说明,cC1具有Annexin基因的典型结构特征,同时也具有Annexin蛋白所共有的生物学活性,因此属于Annexin家族。同时,由于cC1同现有Annexin基因C端保守区域的同源性均低于60%,N 博士学位论文 中 文 摘 要 端同源性低于 20%;因止匕北 不属于任何一个已知的 Annexin亚家族, 而是一个新的 Annexin亚家族成员。根据新的 Annexin命名规则,cCI N该属于B类Annexin基虬 所以命名为Annexin BI 简写为AnxBI AnxBI 是局形动物(platyhelminth)中首次被鉴足的一个 Annexi。。 成员,研究它的生理功能,不仅可以了解AnxBI对于猪囊尾拗的寄生、 移行、生长、发育等生命活动中的重要意义。为治疗和预防该类疾病提 供新的药物靶点,而且可以将猪囊尾蝴作为一种结构简单的模式生物, 研究Annexin在高等真核生物中的生理功能以及分子进化。所以接下来 我们对AflXBI 的生理功能作了初步的探讨。利用 盯-PCR技术研究 Annexin BI在 TS。。i。son删不同发育阶段的表达;发现 A。Xf是囊 尾拗阶段特异性表达的基民 可能与囊尾拗的生长、发育和变态有关; 研究中还发现;重组蛋白GST个 能够显著延长部分激活的凝血活酶 时间(KPTT),因而具有很强的抗凝血活性,该凝血活性可能与AnxBI 结构中四个Ca’”依赖性磷脂结合位点和两个“K-G-D”序列有关:在血 液凝固过程中需要血小板的激活,以形成一个以磷脂酞丝氨酸(PS)为 主的磷脂膜催化表面,使凝血因子X、凝血酶原等凝血固子活化。由于 膜联蛋白具有较强的钙依赖性磷脂结合活性,因而能够竞争性抑制凝血 因子和血小板膜磷脂的结合,从而抑制了凝血因子X等的活化,起到抗 凝血的作用。 AnxBI的抗凝血机理至少说明两点:一是Annexin BI本身不具酶 活性;所以不会引起血液中凝血因子的减少;因而可能不会产生由于凝 血因子的减少而引起的出血等不良反应。二是该 AnxBI的结合位点是活 化血。J、板的膜磷脂。因而可能对以活化血。J、板为主要成分的主动脉血栓 具有高亲和力,所以可用于血栓的导向显像,和以此为载体发展血栓靶 向性的溶栓药物。但问题在于:如果把AnxBI作为抗凝血药物来用;需 要考虑 AflXBI是寄生虫来源的蛋白;具有一定的免疫原性;如果把AI。XBI 作为一种血栓靶向的载体来用,需要考虑AnxBI的分子量较大,为 38 kDa。因此需要进行基因的结构改造。根据AnxBI具有四个同源结构域 的特点;首先模拟构建了一系列突变体群;然后利用同源建模的方法对 4 博士学位论文 中 文 摘 要 各突变体进行结构预测,发现各突变体仍然较好保持了钙结合的活性中 。C。通过能量和结构的优化,选择四个结构最为合理的突变体在大肠杆 菌融合表达系统PGEX-ST中表达,表达产物经纯化后,GST-M3;GST-M4 仍然表达出较强的抗凝血活性。该研究表明:AnxBI的抗凝血活性区域 主要位于C端的前三个结构域,亦即仅仅表达AnxBIC端的前三个结构 域就可以保留 AnxBI的抗凝血活性。这样就使得AnxBI的分子量大大减 小,不仅降低了免疫原性,而且为以此为载体构建具有
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q51

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【共引文献】
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5 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【二级参考文献】
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