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《第二军医大学》 2002年
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抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及其意义

郑国宝  
【摘要】: 结直肠癌是我国较常见、危害性较大的恶性肿瘤之一,近年来,大肠癌的发病率呈上升趋势,其发生和发展是一多基因参与和受多因素影响的复杂过程。虽然国内外学者在大肠癌的基础理论和临床研究方面做了大量工作,并取得了很大进展,但值得注意的是,大肠癌病因学的研究仍无明确定论,发病机制尚未得到实质性阐明,实行根治性手术后,五年生存率远不理想;因此,从分子水平上研究大肠癌的发病机制,寻找与大肠癌发病关系更为密切的致病基因并开辟一条大肠癌生物治疗的新途径就具有很大的现实意义。 对抑癌基因的研究已成为目前癌症研究的热点,至今已发现十余种抑癌基因,新发现的抑癌基因还在不断增加。PTEN自1997年3月被国际上三个研究小组相继独立地克隆后立即成为细胞信号转导、分子生物学和肿瘤病理学等领域的研究热点,是继p53基因发现之后的又一个“明星分子”。该基因编码一种具有双重特异性的磷酸酶,在PTEN的第122-133位的氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)符合蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酶的崔化序列(HCXXGXGRXG),是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,许多学者对该基因进行了多层次全方位的深入的研究,结果表明,PTEN通过对细胞内蛋白质磷酸化水平进行精细调节,影响细胞的生长,增殖,分化,凋亡、粘附和迁移等许多重要生物学行为。1997年以前,人们一直没有找到蛋白磷酸酶与肿瘤形成有直接关系的证据,PTEN作为一个抑癌基因的发现,表明了蛋白磷酸酶活性的降低可以引起肿瘤的发生。 根据目前的研究结果,PTEN主要通过其脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的作用分别抑制细胞内FAK和PI3K两条信号转导通路来实现其抑癌作用。而且认为,PTEN的脂质磷酸酶功能是其主要功能。目前已有人克隆出PTEN剔除的乳腺癌细胞,并且,PTEN蛋白的晶体结构已被确定,这给PTEN基因及蛋白的研究提供了良好的基础。 WP=5 目前的研究认为,PTEN基因的突变或PTEN蛋白的低表达(或缺失表达)与很多恶性肿瘤如神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肺癌等的发生密切相关,而且该基因的缺失表达是全身多种遗传性肿瘤综合征(如Cowden Disease,JPS综合征等)的主要致病因素。然而对于在大肠癌发生发展及转移过程中是否有PTEN基因表达水平的改变,以及这些改变在上述过程中所起的作用,目前报道较少,结果很不一致。本文旨在通过应用Northern Blot、Western Blot、免疫组织化学技术以及基因转染技术,从mRNA、蛋白质和细胞水平上分析大肠癌组织PTEN基因表达水平的改变,进一步阐明PTEN基因在大肠癌发生发展及转移过程中的可能作用及其作用机制。 采用免疫组化和Northern杂交结果显示:PTEN mRNA在大肠癌组织内的表达水平平均显著低于对应的癌旁组织内表达水平。进一步的分析发现,PTEN 5.5kb的转录子表达水平降低与血清中CEA水平、恶性程度分级、Duckes分期呈负相关(p0.05),而与年龄、肿瘤大小、组织类型、浸润深度无显著相关性;2.4kb和4.4kb的转录子表达水平降低与血清中CEA水平、恶性程度分级、组织学类型、Duckes分期呈显著负相关(p0.05),与年龄、浸润深度、肿瘤大小无显著相关性;1.8kb转录子表达水平的降低只与大肠癌的Duckes分期呈显著负相关(P0.05),与其它病理学指标无显著相关性。以2.4kb为参照标准,47例大肠癌标本中,38例表达低于对应的癌旁大肠粘膜(80.85%)。PTEN蛋白在大肠癌旁组织中的阳性率为100%,在大肠癌组织中阳性表达率为76.60%,进一步分析表明,PTEN蛋白在大肠癌组织中表达降低与大肠癌的Duckes分期、淋巴结转移及血清CEA水平呈显著负相关(p0.05),而与患者年龄、肿瘤大小、组织类型、肿瘤的恶性程度分级、浸润深度等无相关性(P0.05)。 用基因转染技术将PTEN基因瞬时转染大肠癌细胞株LOVO后,采用计数细胞悬液加到粘附底物后20 min和120 min的细胞贴壁数用以测定细胞粘附的结果显示:转染了pcDNA3.0及pcDNA3.0-PTEN的LOVO细胞在非特异性粘附底物上20 min、120 min后的贴壁率均与对照细胞LOVO无显著性差异。而在特异性粘附底物Laminin上,LOVO、LOVO/pcDNA3.0、LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞在20 min时贴壁率分别为18.6% ( 1.4%、18.2% ( 1.8%和13.9% ( 0.48%,在加入细胞后的120 min时,细胞的贴壁率分别为71.2% ( 2.5%、69.3% ( 1.3% WP=6 和56.0% ( 1.6%,统计学处理表明,LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞在特异性粘附底物(Laminin)上的贴壁率显著低于对照细胞LOVO、LOVO/pcDNA3.0细胞的贴壁率。结果提示:PTEN基因可显著抑制LOVO细胞在特异性粘附底物上的粘附能力,其抑制粘附的作用可能是影响细胞表面的特异性粘附分子与特异性的细胞外基质的相互作用所致。 采用Costar的浸润小室对LOVO、LOVO/pcDNA3.0、LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞的浸润能力分析结果显示:细胞悬液静置培养6小时后,对照细胞LOVO浸润穿透多聚碳膜的细胞数为11.7 ( 1.74个,LOVO/pcDNA3.0细胞穿透多聚碳膜的细胞数为11.3 ( 1.24个,而LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞穿透多聚碳膜的细胞数为7.5 ( 1.58个。统计学处理表明,LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞浸润能力显著低
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R735.34

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