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哺乳动物白细胞介素10基因修饰的骨髓树突状细胞前体在同种移植中的作用

张明  
【摘要】: 器官移植是现代医学的标志和骄傲,移植医学的发展不仅使人类寿命出现跳跃式的提高,而且带来了生活质量的巨大改善。器官移植发展的50年历史见证了无数患者重获新生的欣喜,然而排斥的阴影从此如影随形。目前的免疫抑制手段显然不是一种最终解决方案,在无系统免疫抑制条件下的移植物长期存活才是移植学界追求的目标。 目前在移植医学的基础科研上有三个方面的发展为我们提供了成功的可能:①异种移植:供体来源丰富,培植容易,可以任意进行基因修饰以适应人类免疫系统,近年来的科研投入很大,成果有目共睹。但是动物源性传染病可能是一个致命的问题;②人工器官:克隆羊的诞生使克隆人体从理论上成为可能,然而伦理的考虑使大部分国家都通过舆论或者立法投了反对票。克隆单个器官是一种理想的方法,但以目前的技术水平绝非能一蹴而就;③耐受诱导:由于器官移植本身的特点,移植是基因治疗的最佳适应症。对供器官或者受者进行基因修饰以诱导供者特异性的移植耐受是非常现实和有前途的方案,尽管这类研究还远未能进入临床。近年来这类研究报道频频见诸期刊杂志,尤以树突状细胞相关的研究成果最为丰硕。 树突状细胞(dendritic cells,DC)作为一类具有最强抗原提呈功能的细胞群体,在识别和递呈抗原启动免疫应答、诱导移植排斥中起重要的作用。人们一直认为,DC是抗原提呈能力最强的抗原递呈细胞(APC),是唯一能够激活初始型T细胞的APC,具有激活移植排斥反应的作用。由于激活排斥反应的DC可以是供者的DC,也可以是受者体内的DC,而存在于供体器官之中的DC,被称为“过客白细胞”(passenger leucocytes),对受体T细胞的直接激活作用,往往是导致急性排斥反应发生的主要原因。因此长期以来,去除移植物中的DC,减少移植物的免疫原性,被认为是克服移植排斥反应最有效的方法之一。但是,近年来的研究表明,DC是一类异质性细胞群体,具有不同的亚群和不同的功能 WP=6 状态,不但在增强免疫反应上具有特别重要的作用,也具有诱导特异性免疫耐受的作用。DC在成熟过程中表型特征和功能上均发生了很大的变化,未成熟型DC显示出较强的致耐受活性,但是通常这种活性随着DC的成熟而转变为强大的免疫原性。1992年,Starzl等在同种异体肾或肝脏移植存活30年以上的病人的血、皮肤、淋巴结中发现了微量的供体白细胞,这表明存在于移植器官中的供体干细胞在受者体内一直存活,提示这种细胞嵌合或微嵌合可以引起免疫耐受和移植器官长期存活。由于发现DC是嵌合细胞的主要成分,从而进一步证实 DC具有引起特异性中枢耐受、也可引起特异性外周耐受的作用。1995年,Lu L等报道表面缺乏共刺激分子,特别是缺乏CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的未成熟型DC能在体外诱导同种抗原特异性的T细胞无能,而通过免疫抑制分子的基因如vIL-10、TGF-β、CTLA4-Ig和FasL等基因修饰能够使未成熟型DC潜在的耐受原性得以放大和增强,使得DC在诱导免疫耐受中具有相当重要的作用及潜在的应用价值。 哺乳动物(包括人、鼠或羊等)的IL-10 (mIL-10) 不同于病毒IL-10 (vIL-10),后者是EB病毒BCRF-I基因的产物,与mIL-10之间在氨基酸序列和蛋白质空间构型上都有着极为广泛的相似性。这两种IL-10有着相似的免疫抑制特性,只是vIL-10不具备mIL-10那样的免疫刺激活性。 mIL-10又被称为细胞因子合成抑制因子,它对许多细胞(例如T细胞、B细胞以及APC等)分泌的大多数细胞因子都有多向性作用。IL-10还能直接影响多种细胞的功能,包括单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、上皮细胞等,这些细胞都表达IL-10受体。对IL-10的研究重点被放在它的免疫抑制活性上,并以此为基础来确定IL-10在移植、肿瘤和艾滋病中的作用。很多研究结果证明IL-10的免疫抑制特性主要是通过它对抗原递呈细胞的抑制作用来实现的,而且其中对树突状细胞的抑制最为显著而且最为重要。这种抑制效应包括降低IFN-γ或IL-4诱导下的树突状细胞及单核细胞MHCⅡ类抗原和ICAM-1(CD54)、CD40、B7-1(CD80)及B7-2(CD86)等一系列膜表面分子的表达;对树突状细胞合成分泌IL-12和TNF-α的能力的抑制;降低细胞之间的粘附能力;另外还有对编码IL-1、TNF-α、IL-12和GM-CSF等细胞因子基因的转录抑制,从而抑制抗原提呈/辅助细胞的功能。 IL-10对免疫反应除有抑制效应外,还有激活效应,前者表现在对抗原递呈 WP=7 细胞的抑制,后者则表现为对CD8+T细胞的激活以及作为多种抗原刺激B细胞及其前体细胞增生的协同刺激因子,协同IL-2激活CD40引起B细胞增生。所以我们利用腺病毒携带的mIL-10基因结构来转染未成熟的树突状细胞,目的是在限制它的副作用的同时最大可能地使它对DC的抑制作用得以强化。 第一部分 mIL-10基因修饰对DCp表型和功能的影响 采用rmGM-CSF与去除淋巴细胞的骨髓细胞体外培养的方法,可获得纯度较高的骨髓来源的DC。观察DC发育过程中的形态变化,发现培养第二天即可见细胞成簇生长,C57BL/6骨髓细胞较BalB/c细胞成簇更早,且簇状细胞团更为密集。换液后细胞被吹散,可见到少量细胞呈现出粗短的枝状突起,培养完成时细胞密集成团,枝状突起仍不多


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