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《第二军医大学》 2002年
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表皮细胞培养中维持干细胞特性相关技术的研究

程大胜  
【摘要】: 目的:(1)利用流式细胞仪检测表皮细胞整合素β1亚基(CD29)和增殖细胞核抗原(PCNA)的荧光标记强度,建立简便易行的表皮干细胞检测方法。(2)利用该检测手段,通过优化表皮细胞分离、培养条件,以提高培养表皮细胞中的干细胞数量。(3)构建人整合素β1基因重组腺病毒载体,转染表皮细胞,观察其生物学特征的改变,为进一步皮肤组织工程研究提供理论基础和研究手段。方法:(1)分离表皮细胞,通过粘附选择富集表皮干细胞和短暂扩充细胞,观察细胞克隆形成率,流式细胞仪检测表皮细胞CD29和PCNA、荧光免疫组织化学检测BrdU的荧光标记强度,分析上述指标间的相关性。(2)利用L16(4~4)正交表设计试验,选择原代培养消化过程中Dispase Ⅱ酶与胰蛋白酶不同浓度和作用时间,以及无血清培养基中EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松的不同浓度为实验因素,考察表皮细胞生物学性状和其中CD29~+/PCNA~-细胞的比例,优化最佳分离和培养条件。(3)利用AdeasyTM系统构建含ITG-β1基因片段的重组腺病毒载体,转染人原代培养表皮细胞,观察细胞克隆形成率和CD29~+/PCNA~-细胞的比例。结果:(1)快速粘附细胞群中CD29~+/PCNA~-细胞的比例约为67.33%,BrdU阳性率为58.57%,S期细胞比例2.95%;而粘附较慢的细胞群中以上指标分别为14.29%、9.84%和16.65%。经相关分析,CD29~+PCNA~-细胞的比例与BrdU阳性率及细胞周期分析间具有良好的相关性(r=0.94,0.87)。(2)胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对表皮细胞24 h贴壁率有显著影响,后者更显著影响了克隆形成率和干细胞比例。0.125% Dispase Ⅱ酶冷消化10h,0.1%胰蛋白酶37℃消化30min,分离的原代表皮细胞中干细胞比例最高,克隆形成率也最高。无血清培养体系中,EGF在对培养人表皮细胞的增殖有显著促进作用,随浓度提高而效应加强。胰岛素、霍乱毒素浓度对培养细胞的增殖也有影响,氢化考的松作用不显著。EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松分别取20ng/ml、5μg/ml、8.4ng/ml、0.2μg/ml浓度时细胞生长及增殖最佳。(3)成功构建了37kb的携带ITG-β1基因的重组腺病毒载体pAd ITG-β1,大小与预计结果相符,并转染原代培养的表皮细胞。转入ITG-β1基因组细胞的克隆形成率显著高于对照组(25.53%vs.7.46%,P<0.01),CD29~+/PCNA~-细胞比例两组间也有显著差异(17.53%vs 7.92%,P<0.01)。结论:(1)CD29~+PCNA~- 细胞比例与鉴定干细胞的基本指标BrdU阳性率及细胞周期均具有良好的相关 性,可以作为表皮干细胞的检测指标。o)对于原代表皮细胞分离培养,0.125% Dispase 11酶冷消化 10 h,0.l%胰蛋白酶 37℃消化 30 min,培养体系中 EGF、 胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松分别取 20 "g/Inl、5 112,Illl、8.4 "g/llil、0.2 gb浓度时,原代表皮细胞中干细胞比例最高。o)成功构建了携带ITG乃 基因片段的重组腺病毒载体,转染人表皮细胞后,能增强细胞的增殖能力,增 加表皮细胞内干细胞比例。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R329.2

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