收藏本站
《第二军医大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究

张洪英  
【摘要】: 口蹄疫是一种烈性传染病,通过空气传播,有广泛的动物宿主,并对人也有感染性,是受到广泛关注的人畜共患病之一。根据国际兽疫局(OIE)1996年文件规定,一旦口蹄疫暴发,所有感染和相接触的动物都必需屠杀。大量动物死亡以及因口蹄疫而引起其他无疫情国家的贸易壁垒将会给经济带来沉重的打击。因此,预防是解决问题的唯一办法。尽管传统的灭活苗已经在很多国家有效地控制了口蹄疫的发生,但是疫苗中灭活不完全的病毒又导致了疾病的暴发。科学家们曾试图用含有病毒表位的合成肽或细菌表达的蛋白制备亚单位疫苗。这些疫苗比灭活苗安全,可以诱导实验动物产生抗体有效地中和病毒,但不能有效地保护家畜抵抗病毒的攻击。然而,DNA疫苗提供了一种选择,因为它的免疫原性和安全性,特别是它不存在任何与活病毒可能相关的危险。 口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成,每个亚单位包含各一分子的VP1,VP2,VP3和VP4,这4个分子组成了病毒壳蛋白P1。据报道,编码P1和病毒蛋白酶3C的非复制型DNA疫苗可以诱导产生抗病毒免疫应答。包含病毒全基因组的复制型DNA疫苗可以在易感细胞中复制,并可以产生更强的免疫应答。然而,在强毒攻击实验中,两种DNA疫苗对免疫猪的保护率只有20%。这可能是由于病毒蛋白酶3C和L抑制了宿主细胞的蛋白合成所致。据报道,这两个蛋白水解酶能水解宿主细胞的翻译起始因子eIF4A或eIF4G,其最终结果是导致细胞凋亡。 因此,科学家们将研究焦点集中在表位DNA疫苗上。最近的一篇报道显示编码口蹄疫病毒位点1的DNA疫苗对猪产生了100%的保护。位点1包括VP1上的141AA—160AA和200AA—213AA两个B细胞表位,是VP1上的优势位点,可以诱导动物产生免疫保护。除了位点1以外,现在已经在O型口蹄疫病毒粒子上发现了4个包含B细胞表位的位点。但是位点1与其他4个位点组合的DNA疫苗至今没有报道。这4个位点分别是位于VP1的位点3,包含40AA—60AA;位于VP2的位点2,包含70AA—78AA和131AA—134AA;位于VP3的位点4,包含56AA—58AA;以及位点5,只有一个氨基酸,即VP1上的149AA。 在本论文中,我们根据GeneBank中O型口蹄疫病毒序列(accession no.X00871)以及相对应的5个位点的序列和VP1上一个通用T细胞表位的序列设计并合成了多表位基因,命名为SG。采用含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头以避免因表位直接连接而产生的相互干扰以及新表位的出现。用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ将SG克隆到DNA疫苗载体—— pVAXI而获得pVAX一SG重组质粒。将pVAX一SG质粒DNA体外转染PKI细胞、BHK一21 细胞或体内转染肌肉细胞,用抗O型口蹄疫病毒的阳性血清进行免疫组化检测,都能 在转染细胞胞浆中发现明显的阳性信号,表明表达的病毒表位被阳性血清识别。而空 载体对照转染的细胞中未发现阳性信号。 为了比较这5个位点的不同组合效果,一共构建了5个质粒载体,并在小鼠体内 进行效力实验的比较。42只小鼠(雌性,4一6周龄)随机平均分成7组,每组6只。1 组和2组是阴性对照组,只注射PBS和pVAXI空载体。组3到组7分别注射构建的5 个质粒载体DNA:pVAX一SG,pVAX一N4,pVAX一Nsl,pVAX一Tsl和pVAX一51。所有的小鼠 都注射2次,每次间隔3周,每次注射体积是100微升,量是200微克。血清中抗O 型口蹄疫病毒的抗体用ELISA检测。脾脏淋巴细胞增殖用标准附T法测定。脾细胞分 泌的工FN一Y和IL一4用ELISA试剂盒定量分析。脾细胞CTL活性用CTL检测试剂盒检 测。CTL的靶细胞是用FuGENE6转染试剂将线形化的pcDNA一SG转染PS 15细胞,然后 用G4 18(0.4 mg/ml一,)筛选得到的病毒表位的稳定表达克隆。这些阳性克隆的表达进 一步用ELISA和RT一PCR得到确定。阳性克隆维持在含G418(0 .1 mg/ml一{2的培养基中。 效应细胞是将分离的脾脏淋巴细胞在体外与全病毒蛋白(10林9 ml一,)共孵育7天而得 到。结果表明只有pVAX一SG,pVAX一N4和pVAX一T51能诱导抗体产生,但是所有的重组 质粒都能诱导细胞免疫应答,如淋巴细胞增殖和明显的CTL活性,以及诱导不同水平 的IFN一Y和IL一4。通过比较发现编码位点5,1和T细胞表位的重组质粒能诱导全面 的免疫应答,并且包含所有5个位点和T细胞表位的质粒pVAX一SG诱导了最强的免疫 应答。 然而,pVAX一SG质粒DNA诱导产生的抗体水平(1:64,n二6)比灭活苗诱导的抗体水 平(1:512,下6)显著低(p司.01)。体液免疫又一直被认为是抵抗病毒攻击最重要的。 所以我们就采取了一系列策略以期提高抗体水平。首先,尝试加大DNA用量:其次, 将人工L一2 cDNA与SG基因顺式表达,中间连接一个工RES片段;第三,用直径12微米 的海藻酸钠微球包裹DNA。病毒特异性抗体用ELISA检测。结果表明三种策略可以不同 程度地提高抗体水平。首先,通过增加注射的DNA量可以提高抗体水平,其中,注射 总量为3毫克的最高剂量组(每隔2周注射一次,共注射3次)获得最高的抗体水平 (1:640)。顺式表达的人工L一2也帮助SG增加了1到2倍的抗体滴度。包裹入微粒的 DNA则腹腔注射提高了2到6倍,肌肉注射提高1到2倍。口服和空载体对照都没有测 到抗体。总之,
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.4

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 郑兆鑫,贺沛富,严维耀,王启松,施文,赵洪兴,周智爱,朱慈晖,徐泉兴,陈嘉棣,李致勋,施履吉;编码口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因片段的化学合成及克隆与表达[J];病毒学报;1989年01期
2 袁清安,王国力,俞炜源,黄翠芬;小鼠单克隆抗体HAb25可变区的人源化计算机辅助设计[J];军事医学科学院院刊;1999年01期
3 吴海祥,郑从义,屈三甫,郭荆哲,王燕丽;口蹄疫病毒诱导宿主细胞凋亡的研究[J];中国病毒学;2001年02期
4 贾战生,周永兴,连建奇,冯志华,李谨革,李光玉,张文彬;抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计和载体的构建[J];中华肝脏病杂志;1999年S1期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 谢永芳,舒坤贤,梁亦龙,袁帅,张继承;小鼠胚胎发育中期肠细胞增殖与凋亡的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
3 康振桥;季艳霞;杨志勇;苏光;崔彦芝;;血管内皮生长因子亚型在人乳腺癌细胞中的表达差异[J];癌变.畸变.突变;2006年03期
4 安刚;黄天华;谢庆东;王德刚;;pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年04期
5 朱斌;杨罗艳;赵晓昆;;膀胱癌多药耐药基因MDR-1与金属硫蛋白-3表达的关系[J];癌变.畸变.突变;2007年05期
6 毕玉平,廖俊杰,单雷,王兴军,徐平丽;番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山东农业科学;1997年06期
7 单雷,毕玉平,王兴军,徐平丽,李广存;双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析[J];山东农业科学;1998年04期
8 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
9 王北艳;曹宁;汤晖;;苜蓿中华根瘤菌电转条件的优化[J];安徽农学通报;2008年11期
10 刘可杰,吕淑霞,沈世华;FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建[J];安徽农业科学;2005年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
2 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
3 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
4 黄达娜;吴少庭;袁仕善;张仁利;高世同;耿艺介;;弓形虫表面抗原SAG1真核表达重组质粒的构建与表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
5 商庆龙;谷鸿喜;;HPV16 L1蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性研究[A];庆祝黑龙江省免疫学会成立十周年(1993—2003)论文集[C];2003年
6 陈振文;赵太云;孙贺娟;路静;王迎;孟霞;曹争和;王钜;;微卫星DNA与生化标记分析对长爪沙鼠群体遗传分析的比较[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
7 王革;王妍;何凌冰;乔刚;朱一松;王君艳;;酵母分泌表达重组人神经生长因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
8 任华;顾建华;孙竹筠;沈万赟;吴鹰;周忠良;;RT-PCR法检测斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA表达[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
9 马珺;陈云霜;王爱善;李仲逵;;珍稀鸟类东方鹳的性别鉴定[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
10 马勋;陆承平;;猪戊型肝炎病毒新疆分离株全基因序列的分析[A];中国科协2005年学术年会“新疆现代农业论坛”论文专集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
2 郭宪;抑制素基因工程疫苗的研究与应用[D];甘肃农业大学;2010年
3 王燕;两株海洋病原菌的分离鉴定、致病机理研究及三株海洋新菌的分类鉴定[D];中国海洋大学;2010年
4 张德庆;C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D];山东农业大学;2011年
5 冯燕梅;卡氏肺孢子菌p55-v3DNA疫苗的构建及其对大鼠免疫保护作用的研究[D];重庆医科大学;2011年
6 于淼;山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D];南京农业大学;2009年
7 魏朝明;中国螽(虫斯)总科昆虫的RAPD分析研究[D];陕西师范大学;2000年
8 贾永清;表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];东北农业大学;2000年
9 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
10 崔俊;c-fms癌基因异常激活机制及携带AFP增强子反义c-fms与肝癌的研究[D];第一军医大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周晓芬;金黄色葡萄球菌肠毒素B作为免疫佐剂的研究[D];华中农业大学;2010年
2 刘莉;HSV-2 gD模拟抗原表位、IL-18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察[D];泰山医学院;2010年
3 夏庆祥;猪C3d分子佐剂增强PRRSV GP5核酸疫苗免疫效果的研究[D];山东农业大学;2011年
4 刘星;BCR-ABL-pIRES-GM-CSF融合基因疫苗在BALB/c小鼠中安全性的检测[D];暨南大学;2011年
5 耿丽;尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究[D];山东大学;2011年
6 芦晓立;羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析[D];甘肃农业大学;2010年
7 郝峰强;口蹄疫病毒前导蛋白(L~(pro))致MDBK细胞死亡方式及其分子机制初步研究[D];甘肃农业大学;2010年
8 赵倩;副猪嗜血杆菌ompP2基因的结构特征及其功能的研究[D];西南民族大学;2011年
9 叶玉秀;生长抑素原核真核双表达质粒的构建与鉴定及作用机理研究[D];华中农业大学;2011年
10 郑绮菡;HSV-2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察[D];泰山医学院;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 柳杨;;病毒感染与细胞凋亡[J];国外医学(微生物学分册);1995年06期
2 石熠慧,汤雪明;细胞凋亡信号的传递途径及其调控[J];细胞生物学杂志;1999年02期
3 郑从义,屈三甫,胡国斌;血液肿瘤细胞凋亡形态学观察的改良荧光染色法[J];肿瘤防治研究;1998年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 金宁一;郑敏;秦晓冰;金扩世;刘棋;马鸣潇;田明尧;李昌;万遂如;;vUTAL3CP1重组载体疫苗与pVIRIL18P1 DNA疫苗在猪体内的免疫原性研究[J];免疫学杂志;2006年03期
2 余云舟,金宁一,王罡;口蹄疫植物疫苗的研究进展[J];吉林农业科学;2004年01期
3 郭慧琛,刘在新,孙世琪,刘光清,谢庆阁;口蹄疫基因疫苗研究进展[J];动物医学进展;2003年04期
4 郭志儒;DNA疫苗免疫新途径[J];中国兽医学报;2001年03期
5 ;口蹄疫的新疫苗[J];中国兽医科技;1971年02期
6 谢庆阁,崔砚林;阿根廷口蹄疫流行与防制[J];中国进出境动植检;1994年02期
7 李万有;浅谈边境地区口蹄疫疫情动态和防制对策[J];中国兽医科技;1999年01期
8 ;行业动态[J];畜牧兽医科技信息;2005年04期
9 ;秘鲁南部暴发口蹄疫[J];中国动物检疫;2005年05期
10 ;控制口蹄疫,英给牲畜打疫苗[J];农村经济与科技;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 潘志明;焦新安;黄金林;唐丽华;张晓明;张小荣;刘秀梵;;携带新城疫病毒DNA疫苗减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及其免疫原性[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
2 杜爱芳;王素华;胡松华;;鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗的免疫原性研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
3 赵以睿;张仁利;朱兴全;;新型DNA疫苗佐剂-DC的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
4 田浪;王红宁;鲁丹;张云飞;王霆;康润敏;;IBV优势表位嵌合基因的DNA疫苗构建与免疫原性研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
5 吴娟;马辉;范小勇;曲;罗玉萍;Douglas B.Lowrie;;内含子A增强Hsp65在真核细胞中的表达效率及提高DNA疫苗在小鼠中的免疫原性[A];中华医学会结核病学分会2011年学术会议论文汇编[C];2011年
6 靳彦文;钟辉;马清钧;;恶性疟原虫DNA疫苗的安全性研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
7 熊金虎;赵民;邱小萍;伍欣星;;人乳头瘤病毒嵌合型DNA疫苗的构建及其免疫效应研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集[C];2003年
8 郑敏;金宁一;田明尧;李昌;秦晓冰;刘棋;贾雷立;张林;;牛对表达口蹄疫病毒复合多表位基因的重组鸡痘病毒以及DNA疫苗联合免疫的免疫应答研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
9 卢永干;;口蹄疫基因工程活疫苗研究新进展[A];中国畜牧兽医学会2003年学术年会论文集[C];2003年
10 郭慧琛;刘在新;孙世琪;云涛;冷青文;马军武;刘湘涛;谢庆阁;;口蹄疫DNA疫苗对豚鼠的免疫效果研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李新生 林甘;世界口蹄疫风云[N];云南科技报;2001年
2 记者 何德功;宫崎种牛染疫 民众震惊抗议[N];新华每日电讯;2010年
3 记者 黄兴伟;英面临口蹄疫新威胁[N];新华每日电讯;2001年
4 魏忠杰;俄接近我黑龙江省地区闹口蹄疫[N];新华每日电讯;2005年
5 记者 陆威 通讯员 苏文广;区督查组到我市检查防疫工作[N];北海日报;2009年
6 乔健 田勇 尚文;羊口蹄疫预防[N];农民日报;2003年
7 龙新;甘肃省临夏县发生家畜O型口蹄疫疫情[N];农民日报;2010年
8 俞志成;猪口蹄疫的防治[N];中国畜牧报;2002年
9 匡继平 赵海东 姜华平;口蹄疫的发生和预防[N];中国畜牧水产报;2001年
10 记者 夏文俊;严防口蹄疫传入我国[N];中国质量报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张洪英;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D];第二军医大学;2003年
2 李福民;水痘—带状疱疹病毒糖蛋白E DNA疫苗的免疫原性研究[D];四川大学;2005年
3 李金福;杜氏利什曼原虫amastin基因DNA疫苗的初步研究[D];四川大学;2007年
4 赫兢;治疗性乙型肝炎病毒DNA疫苗的基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
5 刘勇;轮状病毒VP7基因修饰、表达及免疫原性研究[D];中国协和医科大学;2000年
6 杨志伟;嗜肺军团菌ip/piIE DNA疫苗的初步研究[D];四川大学;2007年
7 易建中;抗A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒重组双价多肽疫苗研究[D];复旦大学;2005年
8 张静;轮状病毒分子流行病学调查及脂质体DNA疫苗研究[D];重庆医科大学;2002年
9 王涛;嗜肺军团菌mip基因DNA疫苗初步研究[D];四川大学;2004年
10 宋立强;异种同源钙激活Cl~-通道DNA疫苗对小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄力;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性[D];河北医科大学;2004年
2 曾政;布鲁氏菌新型疫苗的构建及其免疫原性研究[D];西北农林科技大学;2004年
3 翟雪琼;MP65和Sap2重组表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染的免疫保护作用研究[D];河北医科大学;2009年
4 张秀伟;带有三联密码AAA的Kozak序列对品蹄疫DNA疫苗免疫效果的研究[D];延边大学;2005年
5 刘浩;双启动子质粒pCN-SSIE的构建及作为DNA疫苗的免疫原性检测[D];山东大学;2005年
6 常巧呈;口蹄疫DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C免疫原性的初步研究[D];延边大学;2008年
7 张恒;鸡贫血病毒DNA疫苗的研究[D];山东师范大学;2003年
8 杨帆;鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV_(WHNJ)M基因DNA疫苗研究[D];四川农业大学;2004年
9 周丽丽;布鲁氏菌BLS-L7/L12重组亚单位疫苗的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
10 段鸿元;登革3型病毒prME和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026