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《第二军医大学》 2003年
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肝癌细胞中肿瘤基因P53/MDM2/P21与HBV关系的研究

曲建慧  
【摘要】: P53是一种重要的抑癌基因,当细胞遭受损伤因素作用时,P53活化并激活一系列基因,构成“P53网络”,在细胞周期中发挥校正点功能,阻止损伤的DNA进行错配修复,从而防止细胞发生癌变。MDM2、P21是P53的下游基因,是“P53网络”重要的成员,与P53活性调节及其作用的正常发挥关系密切。p53变异或失活是肿瘤发生发展的重要分子事件。在人类原发性肝癌中,也普遍存在P53功能的丧失,而且由于HBV感染与原发性肝癌的密切相关性,HBV与P53的关系问题一直也是人们研究的热点之一。本研究在P53、HBV状态不同的几种肝癌细胞中检测了P53活性并观察了MDM2/P53/P21三种蛋白表达;观察了P53与细胞DNA切除损伤修复能力的关系;HBV以及HBV增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列与P53的相互作用关系。主要见以下几个部分。 一、不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达及与HBV关系分析 选用背景状态不同的几种肝癌细胞系;HepG2、HepG2.2.15、PLC/PRF/5、HCC-9204、Hep3B,目前已知各细胞内P53状态以及细胞内HBV复制或整合的情况不同。首先用Western blot方法比较了几种细胞系中P53、P21、MDM2蛋白表达量的不同,并通过检测报告基因PG13-CAT、P21-LUC在细胞内的表达观察P53活性以及P53对P21启动子作用的差异。结果表明,PLC/PRF/5细胞具有较高水平的P53蛋白表达,但报告基因PG-13CAT转染细胞后,CAT酶为低表达,这可能由于该细胞中P53蛋白为变异形式,P53半衰期延长造成蛋白表达量增高,反式活化功能却降低或丧失;细胞中P21蛋白存在一定水平的表达,而且报告基因P21-LUC转染细胞后,荧光素酶报告基因也高表达,说明PLC/PRF/5细胞中存 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 在不依赖于P53的途径对PZI的活化表达具有促进作用;而在H即3B细胞,由于 P53全基因缺失,细胞中无P53蛋白表达,P21蛋白以及P21一LUC报告基因处于 相对较低水平:HCC一9204细胞中存在低水平的P53与PZI蛋白表达:与HepGZ 细胞相比,HepG2.2.巧较H即G2具有较高的P53、PZI蛋白表达,而且报告基因 PG13一以T、P21一LUC在H即G2.2.15细胞中表达均高于H即G2细胞,考虑这可能 与细胞中HBV的复制有关。HBv在细胞内的复制可能通过P53依赖或非依赖的途 径对P21具有促进作用。 从MDMZ的表达情况来看,发现MDMZ与P53的表达具有相反的趋势:在姗M2 表达偏低的细胞,P53表达偏高,如PLC/PRF/5,HepGZ(HepG2.2.15)细胞;而 在MDMZ高表达的HCC一9204、H即3B细胞,P53表达偏低或无表达。说明MDMZ对 于野生型或变异型P53可能都具有降解作用。 选用HepGZ、Hepe2.2.15、Hep3B、PLe/pRF/5四种肝癌细胞系。分别给予一 定剂量的紫外线照射,Western blot方法检测P53蛋白表达的改变,用‘H掺入 法通过检测细胞的程序外DNA合成,观察各细胞DNA切除损伤修复能力。结果发 现,PLC/PRF/5细胞在紫外线照射前后P53蛋白表达没有明显改变;H即3B细胞 照射前后P53蛋白均无表达:在H即G2、H即G2.2.15细胞,发现紫外线照射后的 P53蛋白表达明显增强。HePGZ、H即G2.2.15细胞对紫外线诱导的DNA损伤修 复能力明显高于pLc于R卫/5、HeP3B细胞。说明在具有P53活性表达的细胞,紫 外线照射可以通过活化细胞内P53,促进细胞的DNA损伤修复,帮助细胞度过 损伤。HepGZ细胞的DNA切除损伤修复能力相对强于H即G2.2.15细胞,这可 能与HePG2.2.15细胞中HBV的复制有关,提示HBv通过干扰损伤DNA修复,而 与肝癌的发生有关。 二、HBv与P53作用关系初步研究 在上面实验中,发现HePG2.2.15细胞中P53活性以及P53于21表达较HepGZ 明显增高,本实验进一步比较了HePGZ与HepG2.2.15细胞生物学活性以及成瘤 性,并在7721肝癌细胞系中,通过细胞内转染HBV与P53质粒,观察了HBV 对P53活性、蛋白表达以及对P53下游基因PZI基因启动子的影响,以及P53 对HBV病毒复制的作用,并观察了二者作用对细胞凋亡的影响。结果显示, HePG2.2.巧细胞的增殖与凋亡特性均强于H即G2细胞,并且具有成瘤性。7721 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 细胞内转染HBV质粒具有增强P53蛋白表达以及P53功能的作用,使P53对PZI 基因启动子的激活作用进一步增强,细胞凋亡率明显增加,细胞生长抑制。这说 明HBv在细胞内复制对细胞的凋亡与增值均具有增强作用,二者处于对抗平衡的 作用,感染早期,细胞凋亡占优势,而当细胞的增殖占优势时,就会生成肿瘤。 荧光定量PCR方法检测HBv质粒细胞内转染后HBv的复制情况,发现细胞内 P53的表达对HBv的复制也具有一定的促进作用。 三、P53与HBv增强子I上游P53样应答元件结合序列关系研究 前期工作中发现,在HBv基因组增强子I上游存在P53样应答元件结合序 列,TGCC(G)T.··…TGCCT,体外实验发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性 结合;在以上的实验中,也发现P53对HBv的复制具有一定的促进作用(野生型 P53的反式激活作用需依赖于其与DNA序列的特异结合)。本实验进一步观察了 P53与HBV基因组上P53样应答元件结合序列之间的作用关系:报告基因质粒 PX一以T上含有HBV的这段DNA序列,首先
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R735.7

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