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《第二军医大学》 2003年
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垂体生长激素腺瘤靶向性基因治疗的实验研究

马驰原  
【摘要】: 垂体腺瘤虽然是一种良性肿瘤,但其引起的视力视野障碍和内分泌功能紊乱极大地影响了患者的生活质量。传统的手术、药物和放射治疗方法可以治愈大部分垂体腺瘤,但仍有部分患者不能得到有效治疗,寻找新的治疗方法已成为当今神经外科追求的目标之一。基因治疗已经从遗传性疾病、恶性肿瘤发展到其他疾病的治疗,有望成为垂体腺瘤继手术、药物治疗和放疗之外的另一种有前途的治疗策略。目前,国际上已有多个研究中心应用腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因结合更昔洛韦(ganciclovir,GCV)进行了垂体腺瘤基因治疗的实验研究,但存在着可能影响正常垂体细胞功能的副作用。 我们对受体介导的GE7基因导入系统的靶向性转染及垂体生长激素启动子的靶向性转录进行了评价,并将二者结合应用于垂体腺瘤的基因治疗,进行了以下几方面的探索: 1.大鼠垂体生长激素腺瘤(GH_3)细胞、人骨髓瘤(U-2OS)细胞和人卵巢癌(HO8910PM)细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)的表达 目的:判明实验细胞GH_3细胞、U-2OS细胞和HO8910PM细胞的EGFR表达情况。 方法:实验中应用免疫组织化学的方法,取细胞附壁良好的盖玻片,经丙酮固定,1%H_2O_2作用,非免疫羊血清覆盖,依次加一抗、二抗孵化,0.05%DAB+0.03%H_2O_2显色,苏木素衬染、分化,封片,镜检,棕黄色为阳性结果。 结果:GH_3细胞细胞膜上明显黄染,EGFR强表达。HO8910PM细胞细胞膜上亦明显黄染,EGFR强表达。U-2OS细胞细胞膜未见黄染,EGFR表达阴性。 结论:实验证明GH_3细胞、HO8910PM细胞表面EGFR强表达,U-2OS细胞表面无EGFR表达。本研究拟应用EGFR介导的GE7基因导入系统达到靶向性基因转染的目的。这一结果表明:(1)GH3细胞可以作为GE7基因导入系统基因治疗研究的实验细胞;(2)U-2OS细胞可以作为阴性对照细胞; (3)HO89lopM细胞可以作为阳性对照细胞。 2.细胞特异性表达质粒的构建 目的:构建人生长激素启动子(human growth hormone promoter,hGHp)调 控的报告基因及杀伤基因表达质粒。 方法:根据GenBank中hGHp的核普酸序列和基因克隆的要求,用PCGENE 软件进行分析,选择最佳扩增引物,通过聚合酶链式反应(PCR),得到hGHp 的克隆,经测序证实。将作为载体的质粒pGL3一Basic双酶切,并与hGHp粘端 连接,构建报告质粒pGL3一Basic一hGHp。通过相似的步骤完成杀伤基因质粒 peDNA3.1舰isA一hGHp一TK的构建。 结果:PCR反应得到hGHp片段,大小为399bP,DNA测序结果正确。成 功合成质粒pGL3一Basie一hGHp和PeDNA3.1/H isA一hGHp·TK。 结论:应用分子生物学实验技术,可以得到正确的hGHp片段,并通过重 组质粒的方法,成功构建hGHp调控的报告基因及杀伤基因质粒。 3.基因治疗系统转染及表达的研究 目的:评价基因治疗系统的有效性及靶向性。 方法:应用GE7基因导入系统,将报告质粒pGL3一Basic一hGHp分别转染 GH3、U一205及HO8910PM细胞,通过测定报告基因—荧光素酶(lueiferase, Luc)基因表达活性,证明基因治疗系统的有效性和靶向性。同样应用GE7基 因导入系统,将杀伤基因质粒peDNA3.l舰isA一hoHp一TK转染oH3、u一205及 H08910PM细胞,经W七Stem blot检测,证明基因治疗系统的有效性和靶向性。 同时,研究转染GH3细胞的最佳剂量、最佳转染时间及表达时间。 结果:用GE7基因导入系统转染pGL3一Basic一hGHp后,GH3细胞的荧光素 酶活性(77732.25)明显高于U一205(2207.25,p0.001)和HO8910pM细胞 (1958.25,p0.001)。同样转染peDNA3.l胜isA一hGHp一TK的细胞进行Western blot检测,结果显示GH3细胞在约46kD处有一明显条带,而对照细胞则无此 条带。实验表明GH3细胞最佳转染剂量为2.0卜留ml,最佳转染时间为24小时, 基因表达在7天达高峰,之后缓慢下降,但是直至21天仍有较高表达。 结论:(1)研究所采用的基因治疗系统是高效的,能够将足量的目的基因 导入细胞,并保证目的基因有较高的表达。(2)该基因治疗系统具有较强的靶 向性,其中GE7基因导入系统的靶向性转染,将目的基因导入EGFR高表达的 细胞;生长激素启动子的靶向性转录调控目的基因只在分泌生长激素的细胞中 转录并表达;二者结合的双重靶向性保证目的基因只在GH3细胞中发挥作用。 4.基因治疗的体外实验 目的:评价基因治疗系统进行体外细胞杀伤实验的效果和靶向性。 方法:应用GE7系统将pcnNA3 .1舰isA一hGHp一TK分别转染GH3、u一205 和HO8910PM三种细胞24小时,换完全培养液继续培养24小时,加入GCV 0.1林留孔,培养48小时,MTT法观察细胞杀伤靶向性。GH3细胞GE7转染 PeDNA3 .1倪isA一hGHp一TK后,按0,l,2,4,8,16林g/ml6个梯度加入GCv 0.lml/ 孔,培养48小时,MTT法观察GCv的杀伤效果,选择最佳GCv浓度(最低的 有效浓度)。GH:细胞GE7转染peDNA3 .1/H isA一hGHp一TK,24小时后加入Gev, 培养24小时,每隔24小时更换l次GCV,MTT法在第1一7天每天观察杀伤 效果。 结果:在实验中MTT检测表明:(1)GE7转染的peDNA3.l舰
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R736.4

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