脱细胞异种真皮的制备及体外PDGF基因转染复合皮的构建

【摘要】： 皮肤作为人体最大的器官，是机体与外界的屏障，它具复杂的组织结构和许多重要的生理功能。皮肤严重损伤，将引起一系列严重并发症。皮肤损伤修复常用的方法有自体皮移植、同种异体皮移植、异种皮移植。大量临床实践表明，皮肤移植后瘢痕的增生程度与移植皮肤的真皮厚度成反比。因此皮肤缺损的修复要求移植的皮肤应有一定厚度的真皮组织，最好是采用全厚皮片移植或皮瓣移植。但对大面积皮肤缺损(如烧伤)患者来说，由于自体供皮区有限，而不可能采用全厚皮片或皮瓣移植修复所有创面，因此，寻找理想的皮肤替代物一直是临床上亟待解决的难题。随着组织工程学的兴起和发展，组织工程化皮肤为皮肤缺损的修复带来了希望。 自1975年Rheinwald和Green成功地建立了表皮细胞培养方法以后，经过不断技术改进，不仅将培养的表皮细胞膜片应用于临床取得成功，而且与各种真皮替代物一起构成复合皮取得一定进展，已经正式商品化、产业化的组织工程化皮肤也不断出现，并在临床应用中取得满意效果。尽管如此，仍然存在着许多问题，如真皮基质的来源，抗原性去除，角质形成细胞培养的稳定性，复合皮的血管构筑和生长调控等。因此，有必要对组织工程化皮肤进行深入研究。 [目的] 本实验根据猪的皮肤组织和人皮肤组织在结构和功能上的相似性，用低浓度胰蛋白酶消化加反复冻融法制备脱细胞异种(猪)真皮基质；构建血小板衍化生长因子(PDGF)真核表达重组质粒，转染成纤维细胞；在脱细胞异种(猪)真皮基质上培养角质形成细胞、PDGF基因转染的成纤维细胞来构建基因复合皮，从而深入研究组织工程化皮肤的构建。 [方法] 1．将断层猪皮浸入0.05％胰蛋白酶溶液中4℃过夜消化，无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在PBS溶液中持续震荡洗涤，再用同样浓度的胰蛋白酶消化(37℃，1h)，PBS溶液洗涤。然后依次行4℃预冷、—70℃冷冻各2h，再37℃下融化，如此反复冻融3次。进行免疫组化检测、细菌培养试验、细胞毒性试验、大鼠皮下埋植实验。 2．将出生24h内的SD大鼠消毒后PBS清洗，切取全厚皮片。用D-Hanks液新鲜配制的0.01％的胰蛋白酶溶液4℃下酶解18～24h。轻轻刮取真皮表皮面和表皮真皮面的角质形成细胞，密度梯度离心(DGC)分离纯化角质形成细胞，然后在含有添加 第二军医大学憾士学位论文 中文摘要 剂和胎牛血清的FAD培养基中培养。相差显微镜观察，MTT法绘制角质形成细胞生 长曲线，AO荧光染色、FCM检测。 3.从原代培养的人脐静脉内皮细胞中提取总RNA，通过逆转录一聚合酶链反应 (RT-PCR)扩增出hPDGF一B目的DNA片段。通过连接酶连入真核质粒PcDNA3 .1 中，经大肠杆菌DH5a扩增和筛选，构建出重组真核质粒PcDNA3.l一hPDGF一，进 行鉴定。然后转染成纤维细胞，进行表达检测。 4.利用己制备的脱细胞异种(猪)真皮基质、培养的角质形成细胞和PDGF基 因转染的成纤维细胞构建三种类型复合皮:A型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真 皮基质(CK+AX);B型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真皮基质+培养的成纤维细 胞(CK+AX+Fb):C型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真皮基质+P DGF基因转染 的成纤维细胞(CK+AX十P几)。通过相差显微镜观察、组织切片HE染色、 Pancytokeratin、Laminin和W型胶原免疫组化染色等方法进行检测。分别将三型复 合皮分成A、B、C三组，进行动物移植实验，观察皮片存活率、创面收缩率、真皮 血管化程度等，与单纯角质形成细胞膜片移植组(D组)和用凡士林纱布覆盖的对照 组(E组)进行比较。 【结果】 1.制备好的脱细胞异种(猪)真皮基质呈瓷白色，表面(乳头层侧)平整光滑， 有皮肤纹理起伏感，当中有均匀分布的天然毛孔，质地柔软有弹性，光镜下显示表皮 已完全去除，真皮表面光滑完整，上有基底膜，其下为规则排列的胶原纤维，真皮基 质内未见任何细胞成分、毛囊和皮脂腺等皮肤附件及血管存在。扫描电镜显示，真皮 乳头突起和皮钉凹陷呈现规律的凹凸不平，未见表皮基底细胞附着于基底膜。透射电 镜显示真皮乳头层表面可见基底膜结构清晰、连续而完整，胶原纤维排列致密有序。 培养无细菌生长，无细胞毒性，大鼠皮下埋植生长良好。 2.角质形成细胞接种到培养瓶中后，倒置显微镜下观察呈悬浮微球状，约6h 后，细胞沉降，开始贴壁，这时细胞形状为椭圆形，伪足少或无，随着时间推移，细 胞形态变大，伪足增多，呈多角形，两两相连。2~3d后即可见大量的角质形成细胞 贴壁生长，贴壁的角质形成细胞镜下呈多角形，可见多个伪足。细胞3一5d融合，胞 体较大，有一个较大的卵圆形核，染色质颗粒细小而稀少，核着色浅，有的可见核仁。 5~7d可见细胞分层。AO荧光染色显示活细胞百分率为97%。MTT法和FCM检测 细胞生长良好。 3.重组质粒通过Ba浏印和托ndm酶切后，电泳图示o.6kb的h一PDGF一B的目的 一2- 第二军医大学 博士学位论文 甲丈掏要 片段和5.skb的载体片段，证明重组质