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《第二军医大学》 2003年
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报告基因标记的D-氨基酸氧化酶基因及酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因转基因小鼠的建立

何志颖  
【摘要】: 随着分子生物学及其相关学科的发展,肿瘤的基因疗法受到越来越多的关注,有望成为临床肿瘤治疗的一种重要辅助手段,其中自杀基因疗法显示了较好的应用前景。为了探讨自杀基因在临床肿瘤治疗中的应用前景,建立自杀基因肿瘤治疗评价的动物模型,我们克隆了D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)基因和酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)基因,希望建立DAAO基因及YCD基因转基因小鼠,为研究DAAO及YCD基因的生物学特性、开发和评价DAAO/D-Ala及YCD/5-FC自杀基因系统进行肿瘤治疗建立良好的实验动物模型。 来源于红色酵母的D-氨基酸氧化酶可氧化代谢D-丙氨酸(D-Ala),产生对细胞具有杀伤作用的H_2O_2。H_2O_2是一种反应氧(ROS),极易穿过细胞膜及核膜,通过直接氧化或还原产生羟自由基损伤细胞DNA、蛋白质和脂质等而致细胞死亡。哺乳动物组织的DAAO活性水平很低(0.18~780 mU/g湿组织),且局限于过氧化物小体。另外,哺乳动物氨基酸为L型,不含D-氨基酸,因此DAAO基因可望成为新的可用于肿瘤治疗的安全的自杀基因。细菌胞嘧啶脱氨酶(bacterial cytosine deaminase,BCD)是存在于细菌中的一种蛋白酶,不存在于哺乳动物细胞内,它能催化5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转变为5-氟尿嘧啶(5-FU),而5-FU是广泛应用的一种化疗药物,具有广谱抗癌性。研究表明,来源于酿酒酵母菌的胞嘧啶脱氨酶具有比细菌胞嘧啶脱氨酶更高的胞嘧啶脱氨酶活性,YCD/5-FC系统较BCD/5-FC系统具有更高的杀伤效率。 本研究采用基因重组技术分别构建了含有CMV启动子、以绿色荧光蛋白基因为报告基因的DAAO基因表达载体pIRES-DAAO,含有CMV启动子、以红色荧光蛋白基因为报告基因的YCD基因表达载体pIRES-YCD,酶切鉴定证实两载体构建成功。将两载体分别转染Hela细胞,荧光显微镜下可见阳性转染细胞中有绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白表达。阳性转染细胞经筛选后分别加入前体药物D-Ala、5-FC,MTT法检测细胞活力证实,D-Ala、5-FC分别对DAAO、YCD转基因细胞具有杀伤作用,这证实表达载体pIRES-DAAO、pIRES-YCD中DAAO及YCD基因具有功能性表达活性。将pIRES-DAAO用BglⅡ限制性内切酶酶切线性化,采用 WMMffertWWdewrtteat 原核显微注射法将其注射入受精卵雄原核制备转基因小鼠,目前得到19只存活的 新生鼠。经复合式PCR方法检测获得4只Founder转基因小鼠,命名为C57*gN (DAAO)SMMU,其表型正在分析中。同时本研究获得异常死亡幼鼠一只,经 复合式PCR检测为基因组整合阳性鼠,按常规冰冻切片,激光共聚焦扫描显微镜 下可见大部分组织中均有绿色荧光蛋白表达。将plaxs-YCD用BstBI限制性内切 酶酶切线性化,经原核显微注射目前获得9只存活的新生鼠,经复合式PCR方法 检测获得 2只 Founder转基因小鼠,命名为 C571gN(YCD)SloTh。目前原核 注射工作仍在紧张进行中。 同时本研究对前体药物处理后的Hela-Dt细胞和Hela-Yi细胞进行流式细胞仪 分析,结果表明Hela-Dt细胞与Hela-Yi细胞均出现明显的细胞凋亡,这提示 DAAOto叭la及YCD乃FC自杀基因系统可能是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而对 其进行杀伤。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R73-36

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【参考文献】
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