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《第二军医大学》 2004年
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内皮素-1 10-23脱氧核酶的构建及其抗急性缺血性心律失常的实验研究

潘秀颉  
【摘要】:内皮素(endothelin,ET)是一类作用强烈的缩血管肽,主要分布于心血管系统,其生物效应由ET_A及ET_B两种受体介导。ET家族中ET-1的缩血管作用最强,并具有增加心肌收缩力、促心肌细胞肥大等广泛的心血管效应。ET-1与心肌缺血/缺氧关系密切,缺血/缺氧可强烈刺激ET-1表达。已有报道外源性ET-1具有致心律失常的作用,ET_A受体拮抗剂可减少心肌梗塞面积,改善心功能,减少缺血再灌注后心律失常的发生,但对急性缺血性心律失常的观察甚少。10-23脱氧核酶由单链DNA组成,具有稳定的空间结构,可反复切割特定RNA,从而阻断特定基因表达。本工作用体外转录的ET-1全长RNA作为底物,设计ET-1 10-23脱氧核酶,在体外筛选能切割ET-1 RNA的10-23脱氧核酶,将筛选有效的ET-1 10-23脱氧核酶转染心肌细胞,在细胞水平筛选具有生物学效应的ET-1 10-23脱氧核酶;观察ET-1 10-23脱氧核酶对模拟低氧的培养心肌细胞的保护作用;观察ET-1 10-23脱氧核酶对离体灌流的大鼠心脏结扎左冠状动脉前降支(LAD)后60min内急性心律失常的发生和心功能的影响,以进一步明确内源性ET-1在急性缺血性心律失常发生中的作用,为急性缺血性心律失常的防治及ET-1过量表达所致有关疾病提供理论和实验依据。本实验中方差齐性的多组数据采用方差分析,方差不齐的数据则采用秩和检验,P<0.05表示差异有统计学意义。 方法和结果: 1.ET-1 10-23脱氧核酶的设计与体外筛选 (1) 本工作设计的ET-1 10-23脱氧核酶含有15个核苷酸的催化核心及9个核苷酸的底物结合区,其5’及3’端各有两个核苷酸硫代修饰。切割位点为大鼠ET-1 mRNA起始位点AUG起至下游+219核苷酸之间所有AU及GU连接,选出5条与底物结合熵值<-24kcal/mol的脱氧核酶,根据切割位点前后分别命名为DZ1~DZ5。 (2) 抽提正常雄性SD大鼠心脏组织总RNA,逆转录后PCR扩增ET-1全长cDNA,体外转录~(32)p标记的RNA,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA底物,放射 博士学位论文内皮素一1 10一23脱载核醉的构建及其杭急性缺血性心律失常的实脸研究 自显影鉴定,得到长度均一的ET- 1 RNA,电洗脱回收后,用于体外切割试验。 (3)5脚moULET一1 RNA底物与1脚。比10一23脱氧核酶37℃孵育lh,变性聚丙烯 酞胺凝胶电泳分离放射自显影成像,观察到DZZ、DZ3、Dz4及DZS均可切割 ET一1 RNA底物,仅Dzl对底物无切割作用,其中切割位点位于G147u的Dz4, 其两侧结合区结合自由能之差最大,lh切割率最高,达83.5%,DZ3两侧结合 区结合自由能之差最小,其切割效率亦最低,而DZZ和DZS虽两侧结合区结合 自由能之差相等,但DZZ总的结合自由能低于DZS,其切割效率高于DZS。 2.DZ4对心肌细胞ET一1基因表达及细胞肥大的影响 (1)原代培养乳鼠心肌细胞对5’端标记荧光素队M的DZ4的摄取用脂质体转染 标记的Dz4(0.2娜。比)1 Zh后,心肌细胞内无荧光出现,24h后胞核中荧光较强; 采用磷酸钙沉淀转染标记的Dz4的心肌细胞12h后有荧光出现,24h增强,荧光 较脂质体转染强。激光共聚焦显徽镜结果显示,磷酸钙沉淀转染心肌细胞24h后, 细胞胞浆及细胞核中有荧光分布。 (2)脂质体转染心肌细胞24h后,半定量RT一PCR结果显示,血清对照组 ET一l/p一actin条带光密度积分值为0,615土0.044,脂质体对照组为0.617士0.050; 0.1脚ol几DZ4组ET一1/p一actin条带光密度值之比为0.56肚0‘046,与血清对照组 及相应脂质体对照组比较无显著差异(n=5,P0.05);0.2脚ol几Dz4组 ET一1/p一actin条带光密度值之比为0.471士0.053,较血清对照组及相应脂质体对照 组明显降低(n=5,p0.05)。血清对照组与两个脂质体对照组之间,ET一1/p一actin 无统计学意义。实时荧光定量PCR结果显示,脂质体转染心肌细胞24h后, o,1卿ol几Dz4组ET一1 mRNA表达量与血清对照组之间无显著差异(n二3, P0.05);0.2脚叮0比Dz4组ET一1 mRNA表达量降至血清对照组的6肚10%(n=3, P0.05)。磷酸钙沉淀转染心肌细胞24h后,实时荧光定t PCR结果显示血清诱 导组ET-1 mRNA增高至非诱导组的12妊11%(n==3,Po.05),0.1脚ol/L Dz4组 ET- lmRNA含t降低至非诱导组的94月0%(n=3,p0.05),明显低于血清诱导组 (二3,po,05)。0.2脚叮O比Dz4组降低至非诱导组的6肚6%(n=3,p0.05),显著低 于非诱导对照组、血清诱导组及0.1脚。比DZ4组(二3,p0.05)。反相结合序列 对照组0.2林mo比rDz4转染24h后,ET一1 mRNA表达量与血清诱导组相比无显 著差异(n=3,护。,05)。 博士学位论文内皮素一1 10一23脱氧核踌的构建及共杭息性缺血性心律失常的实脸研究 (3)血清诱导肥大心肌细胞经脂质体转染Dz4 24h后,0.2卿。比Dz4组的细胞 活力与脂质体对照组比较细胞活力降低27%(n=8,p0 .05),细胞总蛋白下降 33%(n=5,p0 .05),蛋白质合成速率下降34%(n=5,p0.05),0.1林m01几DZ4 组改变不明显。磷酸钙沉淀转染24h后,血清诱导组与非诱导组相比细胞活力改 变不明显,细胞总蛋白增加39%(n=5,p0.05),蛋白质合成速率增加45%(n二5, p0 .05):0.1脚mo比Dz4组的细胞活力与血清诱导组相比细胞活力改变不明显, 细胞总蛋白下降29o/ofn=5,p0 .0
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R541.7

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