小鼠肝干细胞存在的病理学依据及其在肝再生中的作用

【摘要】：在个体发育中，细胞有分化等级差异——从受精卵、胚胎干细胞、各级多能干细胞到有成熟结构和功能的各组织、器官的细胞。个体发育完成后是否某些等级的干细胞仍存留于个体的组织器官中呢?生命历程中，组织器官不可避免地经历生理性或病理性细胞丢失和再生。存留于造血系统、表皮和肠上皮中的干细胞在这种再生中发挥了关键作用。肝脏中又是什么情况呢? 有报道多种物理或化学损伤后肝脏几乎可以完全再生。成体内有没有肝干细胞?几种来源?肝再生是通过肝细胞增殖或通过被推论的肝干细胞增殖完成或通过它们两者共同完成的呢?许多学者为此做了很多工作，但观察结果和认识并不很一致，尚有几方面悬而未决的问题：①肝干细胞的存在和来源存有争议，尤其是骨髓肝干细胞和小肝细胞；②肝细胞和肝干细胞在肝再生中的作用：一方面，有报道认为2／3肝切除(PH)后大鼠肝再生系单独由肝细胞分裂增殖完成；另一方面，在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering's管(COH)的卵圆细胞(OVC)被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞；与之不谋而合的是Zajicet的流动肝假说。但是：正常肝内并未发现有OVC；在使用肝细胞增殖分裂的抑制剂(例如倒千里光碱，RS)结合急性肝损伤的条件下有OVC出现，但也有人报道此时是由肝小叶内小肝细胞完成肝再生的；另外还有人认为骨髓细胞可能是帮助损伤肝再生的肝干细胞来源，但也有持相反观点的报道。本组已应用RS／PH模型诱导小鼠OVC产生、建立了稳定传代的C57小鼠肝干细胞候选细胞LEPCs细胞系，但在复习既往切片时偶然发现PH对照组肝内有个别卵圆样细胞及肝窦内有小核分裂相，这些现象值得探究以便更深理解肝干细胞在肝再生中的作用。③有报道大鼠和人骨髓细胞可在肝内(转)分化为肝细胞，但却未知体外培养的小鼠成体肝内源性、易于扩增的HSC候选细胞是否经长期传代后仍能维持肝干细胞特性、并能植入肝脏增殖分化为肝细胞以参与受损肝重建。 为此，本研究针对上述问题展开工作，主要方法、结果和结论概述如下： 1．得到C57小鼠不同来源的肝干细胞候选细胞：骨髓细胞(BMC)、胎肝源上皮样集落形成细胞(FECFC)和两种肝内源性成体肝上皮样集落形成细胞(LEPCs和HECFC)。细胞体外诱导分化、回输体内脾结节形成实验和受体内衍生于骨髓供体细胞的Mx-Cre 余宏宇博士论文 小鼠肝干细胞存在的病理学依据及其在用再生中的作用 和sry的检测(免疫组化和PCR)，表明:这几种来源(骨髓源、胎肝源、成体肝内源) 的细胞具备肝干细胞特性。另发现肝损伤还能使骨髓源脾结节细胞肝胆标志表达增强。 2.病理观察肝再生中肝l胆管细胞、OVC和肝细胞源大核分裂相及肝干细胞源小核 分裂相，发现:1) RSIPH组:小核分裂相所反映的内外源肝干细胞(包括OVC)可能 是肝重建的决定因素，其中窦板交界处小核分裂相可能是骨髓源肝干细胞参与肝重建的 形态学证据;2)RS组，4天后小核分裂相逐步增多，可能反映了内外源肝干细胞在肝 细胞更新中的作用:3)大小核分裂相所反映的肝细胞与肝干细胞可能不仅是单纯PH 组肝重建的共同决定因素，而且可能共同参与了正常对照组和假手术组肝细胞的更新。 结合上述结果和相关报道，提出了肝流域假说—肝内源性成体肝干细胞存在于小胆管 /coH附近，其能复制、产生子代(由OvC经小肝细胞)向肝细胞分化:不同分化等级的 细胞从小胆管/C0H附近流经肝板汇向中央静脉，形成该流域干流;由血循环路过的外源 性干细胞在干流不同的部位分裂增殖、部分转分化为肝系细胞，作为支流汇入干流。生 理性肝细胞更新和病理性肝重建实际上是肝流域中三种成分(位于小胆管/C0H附近的肝 干细胞/OVC，有有限增殖潜能的成熟肝细胞和外源性干细胞)共同对肝再生信号作出反 应的结果。 3.肝内源性成体肝干细胞系(LEPCs)在体外转入由Alb启动子/增强子调控的绿色 荧光蛋白真核表达质粒，用脾注射法移植到小鼠CC14肝损伤模型中，通过供体源细胞 的绿色荧光检测及连续冰冻切片的H一E染色和Alb免疫组化染色，观察到体外培养的 LEPCs能植入受损肝并增殖分化为具有正常形态和功能的成熟肝细胞、帮助损伤肝重 建。