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《第二军医大学》 2004年
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1.糖皮质激素受体拮抗剂RU486导致大鼠腹腔巨噬细胞易感化及其机制 2.糖皮质激素诱导细胞内PKCα蛋白增多的机制

朱晓燕  
【摘要】:我们实验室以往的研究发现,应激、全身炎症反应综合症(systemetic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)时糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)特异结合明显减少,且病情越重,GR特异结合减少的幅度越大,进一步研究发现预先给大鼠注射RU486阻断GR后再给予内毒素或放血,则大鼠的炎症变化明显加重,因此本实验室范杰、徐仁宝等提出GR结合降低,体内抗炎机制减弱可能是SIRS、MODS发生的一个机制。作者认为这结果还提示注射RU486可能使机体的白细胞处于易感状态(priming state),使得机体对“第二次打击”的抵抗力下降。为证明这一点,本论文第一部分的工作首先利用注射RU486导致GR阻断的大鼠模型,选择炎症介质一氧化氮(nitric oxide,NO)为指标,观察腹腔巨噬细胞是否处于易感状态。结果发现注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞12h内生成NO的基础量以及用脂多糖(LPS)处理12h后所生成NO的量均明显高于对照大鼠,说明注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞确实处于易感状态。 白细胞易感化的机制非常复杂,不同的刺激因素导致不同的细胞易感化的机制各不相同。已有的研究结果提示G蛋白活化、磷脂酶D(PLD)活化、[Ca~(2+)]i升高及酪氨酸激酶活化等都可能与白细胞易感化有关。作者前一阶段的研究表明蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和[ca~(2+)]i在机体的易感化中起着重要作用,因此本论文重点研究了注射RU486引起的巨噬细胞的PKCα和[Ca~(2+)]i的变化。结果发现注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞的[Ca~(2+)]i和PKCα蛋白均明显高于对照大鼠。 以往的实验表明注射RU486阻断GR的同时,还使大鼠体内的糖皮质激素(glucocorticoid,GC)显著增高。因此本文采用单侧肾上腺切除(Adx1)注射RU486的模型(本实验室的前期工作表明给Adx1大鼠注射RU486能够显著降低注射RU486引起的血浆GC浓度的升高),进一步探讨GR阻断和GC在巨噬细胞易感化过程中的作用。结果显示Adx1不同程度地降低了注射RU486大鼠PM的NO生成量和[Ca~(2+)]i增多的水平,同时可使PKCa增多完全逆转,提示血 第孟军医大学博士李位论式 朱晓庆 浆GC升高不同程度地参与了注射RU486导致大鼠PM易感化的过程。此外在 注射RU486导致GR阻断近90%的条件下,血清中GC浓度下降同时伴随着腹 腔巨噬细胞PKCa蛋白的减少,提示GC有GR非依赖性升高PKCa的作用。 考虑到肾上腺分泌多种激素,肾上腺切除必然也影响到其他激素的血清浓 度,因此我们又在体外研究了GC和GR阻断对小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7 的No生成、IC扩+]i和PKc蛋白的影响。结果发现Gc能够抑制RAW264.7细 胞生成NO,RU486可以完全逆转GC的这种作用,而在同样浓度的RU486作 用下,不同浓度GC对RAW264.7细胞生成NO的作用没有明显差异,说明GC 对NO生成的抑制完全通过GR的介导。此结果还提示在体实验中注射RU486 大鼠腹腔巨噬细胞NO生成增多主要是由于在生理状态下血浆中的GC通过GR 的介导起着抑制NO生成的作用,而GR阻断则抑制了GC的这种作用,从而使 巨噬细胞生成NO增多。而Adxl不完全逆转注射RU486大鼠NO生成增多的 作用则可能是由于Adxl时除GC外的其他因素的变化所引起的。实验结果还表 明地塞米松(dexamethasone,Dex)能够诱导RAW264.7细胞[CaZ+]i升高,而RU486 不能完全阻断Dex的这一作用。Dex和皮质酮(eortieosterone,B)均能诱导 RAW264.7细胞内PKCa增多,且呈明显的剂量一效应关系,而RU486并不能 阻断Dex诱导细胞内PKC。升高的作用,提示这一作用与GR无关。 以上结果说明注射RU486导致大鼠巨噬细胞易感化的机制至少部分地是由 oe增高(使[CaZ+]i和pKCa升高)和GR特异结合降低(使NO生成增多)共 同作用的结果。由于注射RU486引起的GC和GR的变化与应激时变化是一样 的,因此可以对本实验室范杰、徐仁宝等于1994年所提出的应激时由于GR特 异结合降低,抗炎机制减弱,从而加重SIRS、MODS的假说作如下的补充:应 激、特别是严重损伤时,GC分泌增加,使「CaZ+]i和PKCa升高,与此同时GR 特异结合降低,抗炎机制减弱,使NO等炎症介质的生成增加,二者的协同作用 使白细胞易感化,甚至使白细胞活化;在此基础上,如再遭受感染、出血等“第 二次打击”,就容易发生SIRS、MODS,或使其加重。 由于RU486并不是非常专一的GR拮抗剂,它同时也是孕激素受体的拮抗 剂,因此我们进一步利用RNA干扰技术,观察GC对内源性GR表达knock down 的RAW264.7细胞中PKCa蛋白表达的影响。我们首先设计了两段特异性针对 第二军医大学博士学位论次 朱晓及 GR的siRNA(small inierferenee州A)序列并构建了它们的表达载体psileneer 1.0一U6一GRI和2,分别转染RAW264.7细胞后,用Rl’- PCR、W亡stem blot以及 GR报告基因检测的方法鉴定,结果发现其中psilencer 1 .0一u6一GRZ能够有效地 阻断GR表达。进一步我们将这段序列克隆到siRNA稳定表达载体psileneer 2.1一U6并建立了稳定的GR灿ockdo帅的 RAW264.7一GR(一)细胞系。用GC分别 处理psileneer 1 .0一U6一GRZ瞬时转染的RAW264.7细胞和RAW264.7一GRC)后,结 果发现在内源性GR
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R363

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