收藏本站
《第二军医大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的生物学特性研究

訾晓渊  
【摘要】:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)可引起人类的急、慢性乙型肝炎,而且与肝硬化和肝细胞癌的发生有十分密切的关系,对人类的健康构成了严重的威胁。HBV具有宿主特异性,在自然情况下,HBV不感染医学科学研究中常用的实验哺乳动物——小鼠,80年代中期,由于转基因动物技术的应用,乙肝转基因小鼠模型陆续地在一些发达国家和地区的实验室里出现。由于知识产权的保护以及专利制度等多种因素的限制,我国一直未能引进国外的全基因组乙肝转基因小鼠品系。因此,尽快在我国自行建立一个符合国际标准的、可大规模推广应用的乙肝全基因组转基因小鼠模型是十分必要的。另外,由于HBV有至少4种血清亚型(adr、ayr、adw和ayw),它们在基因组结构、生物学特性和流行地域等方面都存在着一定的差异。在我国流行的主要是adr亚型,所以,我们需要的动物模型应该是相对应的adr亚型的乙肝全基因组转基因小鼠模型。本课题就是利用我们实验室建立并优选的乙肝全基因组转基因小鼠C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU“3号”品系的F6-F17代小鼠为实验对象,从DNA、RNA、蛋白质、病毒学、病理学和免疫学角度,综合研究了该品系转基因小鼠的生物学特性,使其成为可应用于乙型肝炎病毒相关研究的实验动物模型。 本研究采用基因组DNA PCR、Southem blotting和DNA测序的方法,分析了HBV基因在转基因小鼠中的整合特征,结果表明,adr亚型的乙型肝炎病毒全基因组转基因已稳定的整合在转基因小鼠的基因组中,并能通过生殖系以孟德尔遗传方式在世代间稳定遗传。利用RT-PCR和real-time RT-PCR对转基因小鼠肝组织中的总RNA进行定性和半定量检测,分析了HBV基因在转基因小鼠中的转录特征,结果发现,转基因小鼠中整合的HBV基因能够转录出病毒的所有mRNAs,病毒mRNA的半定量检测可用于评价抗病毒治疗的研究,是评价该转基因小鼠的重要指标之一。通过免疫组织化学、血清ELISA和Western blotting方法,分析了HBV基因在转基因小鼠中的表达和分泌特征。肝组织免疫组织化学分析显示,转基因小鼠肝细胞中表达HBsAg、HBcAg和X蛋白三种病毒蛋白,但并不是所有的肝细胞同时表达HBsAg、HBcAg和X蛋白。三种病毒蛋白的检出率分别为:85.82%(HBsAg)、58.25%(HBcAg)和49.61%(X蛋白),HBsAg分布于肝细胞质中; 勺r叼匕洲博d匕学位论文 乙习跳刀千失病毒全基因启区粉吞因小民的生物学特性减玲究 HBcAg和x蛋白既可分布于肝细胞核中,也可分布于肝细胞质中。免疫组织化学 检测可直观的反映转基因小鼠体内病毒蛋白的表达情况,也是评价该转基因小鼠 的重要指标之一。血清EuSA和认触ste讯blo翻谊g分析发现,转荃因小鼠肝细胞中 表达的病毒蛋白可分泌入血,小鼠血清中HBSAg和HBeAg的检出率分别为: 55.20Ok和25.000/0,但HBsAg和HBeAg的存在时间和水平并不同步,具有明显的 个体差异,另外,转基因小鼠中HBsAg的表达还具有发育调节和性别相关性。采 用血清DNA PCR、reai一me PCR的方法,分析了转基因小鼠中1{BV的复制、病 毒颗粒的包装和分泌特征。对小鼠血清DNA进行PCR和real一time PCR分析发现, 转基因小鼠血清中存在HBV DNA,其含量达到临床患者阳性标准,表明转基因小 鼠中整合的HBV基因组DNA可复制包装成病毒颗粒并分泌入血。血清中HBV DNA的定量检测简便准确,也可用于评价抗病毒治疗的研究,是评价该转基因小 鼠的重要指标之一。 我们进一步对该品系转基因小鼠进行了组织病理学、血清酶学和免疫学的检 测,分析了转基因小鼠的病理学和免疫学特征。肝组织H一E染色分析发现,部分 转基因小鼠肝组织中出现了不同程度的肝细胞变性(45.52%)、肝细胞坏死区和汇 管区数量不等的单个核细胞浸润(47.01%)。浸银染色分析发现,29.10%(3 9/134) 的转基因小鼠肝组织出现了纤维组织增生,特别是单个核细胞浸润处。肝细胞的 这种病理损伤与转基因小鼠的月龄密切相关,随着月龄的增加,转基因小鼠肝脏 损伤的发生率和严重程度均增加;另外,肝细胞的变性还与病毒蛋白的表达成负 相关。透射电镜分析发现,转基因小鼠肝肾脏组织发生了超微病理损伤,主要有: 线粒体肿胀、线粒体晴消失、内质网扩张、髓样体结构形成、胶原纤维增生。肝 组织中还有糖原增加、脂滴储积、部分肝细胞溶解等慢性损伤的超微病理改变; 而肾脏则出现了基底膜增厚、钉突消失、基底膜上出现沉积物、部分细胞核空泡 样变性等变化。血清酶学分析发现,少数转基因小鼠血清转氨酶(ALT和AST) 升高。这些结果表明,转基因小鼠发生了与人类慢性HBV无症状携带者相似的肝 组织病理性损伤,总体为轻度慢性肝炎。采用流式细胞术对该品系转基因小鼠外 周血T淋巴细胞及其亚群分析发现,转基因小鼠外周血CD犷、CD4+、CDS+T细 胞和CD4勺CDS+均下降;免疫组织化学检测发现,肝组织中浸润的单个核细胞CD3 常二二润民吸大学细鹿生物攀欲戈开宜 份晓渊俘创匕学位论文 乙裂朴炎漪每苦卜刃‘因粗转苏因小且的生物学特性月开究 和CD4阳性,CDS和CD57阴性:血清ELISA分析发现,转基因小鼠血清A刀ti一HB示 Anti一HBc、Anti一HBe阴性。 本课题的研究表明,我们建立的乙肝转基因小鼠C57
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R-332

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐光勇,龚建平;转基因与移植耐受研究进展[J];国外医学.泌尿系统分册;2005年01期
2 石炳毅;器官移植免疫耐受的研究进展[J];解放军医学杂志;2002年10期
3 李国强,王学浩,孙倍成,钱建民,李相成,张峰,俞悦;转Fas配体基因的树突状细胞在诱导大鼠肝移植免疫耐受中的作用[J];中华器官移植杂志;2003年01期
4 王颖;;转基因人体实验已扩展到欧洲[J];生物技术通报;1991年08期
5 黄建,成国辉,陈耀富,印木泉;建立转基因小鼠突变研究模型的研究[J];癌变畸变突变;1995年04期
6 李政,刘德培,刘庆辉,郭志晨,章秋珩,李志杰,贾佩臣,梁植权;带红系增强子的人β珠蛋白基因在转基因小鼠中的表达[J];中华医学杂志;1998年01期
7 陈筱侠;用核移植技术获得表达人凝血因子Ⅸ的转基因绵羊[J];上海实验动物科学;1998年02期
8 张树忠,刘艺萍,梁家靖,王新民,李建秀,沙继红,胡以平;HBV adr亚型转基因小鼠的鉴定与病理作用研究[J];癌变畸变突变;1999年06期
9 衣服新;基因小鼠在肿瘤研究中的应用[J];锦州医学院学报;1999年04期
10 朱进!210002,张云!210002,郭恒彬!210002,唐家琪!210002;轮状病毒疫苗与转基因植物[J];中华预防医学杂志;2000年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭力;邵琳琳;刘新光;彭军;侯明;;血小板MHCⅠ类抗原分子介导CD61特异性细胞毒性T细胞免疫耐受的机制研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
2 福军亮;王福生;;调节性T细胞与HBV感染免疫耐受和疾病进展的相关性研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
3 魏于全;田聆;;免疫耐受与肿瘤免疫治疗[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
4 符静;夏月根;张晓娟;;联合疗法治疗慢性乙肝免疫耐受型疗效初探[A];中国中西医结合学会第十二次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编[C];2000年
5 潘崚;郭晓玲;蔡圣鑫;董作仁;;G-CSF诱导异基因造血干细胞移植供者T细胞免疫耐受机制初探[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
6 张方;施毅;李子玲;胡波;宋勇;;mTSLPR-Ig调节树突细胞诱导哮喘小鼠免疫耐受的研究[A];中华医学会第七届全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第三次大会论文汇编[C];2010年
7 张临友;张学峰;王俊峰;郭晓彤;姚志发;夏求明;;恒河猴外周血pDC1诱导免疫耐受功能的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
8 林春景;吴金明;黄智铭;吴建胜;;慢性乙型肝炎免疫耐受期患者HBsAg基因多态性研究[A];2007年浙江省消化系疾病学术会议论文汇编[C];2007年
9 王福生;;CD4+CD25+调节性T细胞和乙型肝炎免疫耐受特点的研究[A];2006年慢性乙型肝炎治疗进展研讨会资料汇编[C];2006年
10 吴金明;林春景;;慢性乙型肝炎免疫耐受期患者HBsAg基因多态性研究[A];2008年浙江省内科学学术会议论文汇编[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 沈寅 张双 王星;转基因 你了解多少?[N];人民日报;2005年
2 伊 鹤;玉米转基因维E含量增[N];大众科技报;2003年
3 陈文;美科学家培育出转基因抗病葡萄[N];农民日报;2002年
4 董峻 陈炜伟;大力推进农作物转基因发展[N];农资导报;2010年
5 本报记者 崔悦;转基因:前途光明道路曲折[N];新农村商报;2010年
6 记者 白田田;转基因产业化步入深水区[N];经济参考报;2010年
7 记者 王艳红;美科学家育出转基因抗病葡萄[N];新华每日电讯;2001年
8 黄海;法国葡萄酒获准使用转基因葡萄[N];中国食品报;2010年
9 本报记者 陈炜;一言难尽转基因[N];国际商报;2010年
10 曹学仁;欧洲转基因支持率下降[N];农资导报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵鸿;未成熟树突状细胞联合骨髓移植诱导大鼠异体肾移植免疫耐受的研究[D];复旦大学;2003年
2 刘阳;自身免疫性糖尿病模型鼠免疫耐受机制异常的研究[D];吉林大学;2006年
3 祝哲诚;免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D];复旦大学;2003年
4 王伟;诱导免疫耐受治疗心脏移植后排斥反应的实验研究[D];山东大学;2004年
5 刘丹;STZ诱导1型糖尿病模型免疫耐受机制异常的研究[D];吉林大学;2005年
6 徐东亮;核因子-κB寡聚脱氧核苷酸诱骗剂处理的供受者树突状细胞诱导免疫耐受的实验研究[D];复旦大学;2004年
7 訾晓渊;乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的生物学特性研究[D];第二军医大学;2004年
8 蒋智军;肝脏星状细胞在大鼠原位肝移植免疫耐受诱导机制中的作用[D];浙江大学;2007年
9 赵君;Bcl-2及c-myc乳腺定位表达系统和转基因小鼠建立研究[D];中国人民解放军军需大学;2002年
10 李秀东;小鼠骨髓间充质干细胞诱导异基因肝移植模型大鼠免疫耐受的研究[D];吉林大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张楠;重组HLA-G分子对RA外周血T淋巴细胞抑制作用的研究[D];大连医科大学;2006年
2 翟红利;农杆菌介导获得转双价抗虫基因籼稻及其后代的初步研究[D];福建农林大学;2002年
3 李铁庄;转基因抗虫陆地棉推广的实证研究[D];中国农业大学;2004年
4 黄伟奇;转ATP/ADP转运蛋白基因水稻的获得及其初步研究[D];福建农林大学;2005年
5 郭剑华;转基因泡桐的Shiva-Ⅰ基因表达与遗传的初步研究[D];华中农业大学;2003年
6 张连明;转基因微细作业系统中超微量注射控制器的研制[D];广东工业大学;2004年
7 田利源;乙肝结合蛋白转基因小鼠的研制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
8 邢汉前;HBV慢性感染患者免疫耐受期肝组织免疫细胞的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
9 陈昊;转化生长因子β1抑制T淋巴细胞功能及其相关机制的体外研究[D];安徽医科大学;2005年
10 郭佳;杉木的遗传转化研究[D];南京林业大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026