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诱导型环氧合酶与动脉粥样硬化关系的实验研究

李洪涛  
【摘要】:背景和目的: 在动脉粥样硬化(AS)的发生、发展过程中,炎症反应具有重要作用,它贯穿于AS病变的各个阶段,同时也将AS病理改变与各种危险因子、临床心血管事件联系在一起。胰岛素抵抗(IR)不仅是AS的等危症,同时也是一种低水平的炎症,高浓度胰岛素(INS)通过激活细胞内信号转导通路,促进细胞增殖或炎性细胞因子表达。诱导型环氧合酶(COX-2)在炎症性疾病中起着重要作用,同时与AS关系密切,可能是防治AS或急性冠脉综合征(ACS)潜在的新靶点。本研究以人的冠脉标本为观察对象,比较了不同类型AS斑块中COX-2的表达,以探讨COX-2与AS病变以及AS斑块稳定性之间的关系;以高浓度INS刺激体外培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMC)、人内皮细胞(EC),以COX-2抑制剂(NS-398)进行干预,观察其对INS刺激的影响;在VSMC中,从基因、蛋白、酶活性三个水平观察INS对VSMC表达COX-2的影响.并探讨丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与INS诱导COX-2的关系;以含人COX-2cDNA的表达载体(pCMV-COX-2)转染内皮细胞(EC),观察阿司匹林和选择性COX-2抑制剂NS-398对转染后的EC表达细胞间粘附分子(ICMA-1)的影响,从而探讨COX-2抑制剂潜在的抗AS作用。 方法: 1、45个人冠脉标本根据AHA组织学分类定义和HE染色病理特征,以炎细胞含量为标准,分为正常冠脉(无炎细胞)、纤维斑块(轻度炎症、炎细胞25%)、和复合斑块(炎细胞≧25%)组,复合炎症组中再分为中度炎症组(炎细胞50%)和重度炎症组(炎细胞≧50%)。分别进行COX-2免疫组化染色,观察COX-2在不同类型AS病变处表达的分布情况,COX-2染色阳性细胞超过50%定为+++,6%—50%为++,5%以下或轻度染色为+,无染色为阴性(一)。 2、原代培养大鼠VSMC、以终浓度分别为10、100、500、1000mU/L的INS, 第二军医大学博士毕业论文 中文摘要 l、5、10、50、100uM的NS一398,以及二者共同刺激细胞24、48、72小时, M竹法检测细胞吸光度反映VSMC增殖情况。2、培养人EC株,终浓度分别为 10、100、500、1000mU/L的州S刺激6小时,100mU几的INS刺激l、3、6、 12小时,10uM的NS一398与不同浓度的取S共同刺激细胞6小时,Rl’- PCR检 测EC中ICAM一1表达。 3、VSMC经INS不同浓度和时间刺激后,R不PCR、W匕stern一blot检测取S 诱导COX一2的时效性和量效性,EIA检测VSMC合成的PGE:代表COX一2活性; W匕stem一blot检测阿司匹林和NS一398对COX一2蛋白表达的影响;以PD98059 (P42/4 4MAPK抑制剂)和SBZo358o(p38MApK抑制剂)以及磷酸化JNK抗 体、检测INS诱导COX一2的细胞内信号转导通路。 4、pCMV-C0x一2扩增和酶切鉴定后,通过脂质体(Lipofectin)转染人Ec, RpPCR和W七stem一blot检测目的基因和蛋白表达;Rl’- PCR检测转染后引起的 ICAM一l表达、以及阿司匹林和NS一398的影响。 结果: 1、COX一2主要在AS斑块处表达,正常冠脉未见COX一2表达,纤维斑块组 COX一2表达为(一~+),中度炎症组为(+一++),重度炎症组为(++一+++), COX一2在正常冠脉、纤维斑块、复合斑块中的阳性率分别是0、22.7%、100%, COX一2的表达量在复合斑块中明显高于纤维斑块,重度炎症组中明显高于中度 炎症组,并与斑块炎症程度显著相关(p二0.000,尸0.887)o 2、随着州S作用时间和浓度的增加,VSMC增殖明显增加,呈时效和量效 关系(0.000轰p委0.041,0.4ox丢r聋0.760)。NS一398对VsMC的增殖无明显影响 (P0.05),但可以抑制INs引起的vsMC增殖。INs刺激Ec可引起 IcAM一1 mRNA表达,而且IcAM一1表达随INS作用时间和浓度而增加(p0.01)。 Ns一395与取S共同刺激后,EC表达ICAM一无明显变化(p0.05)。 3、10、100、500、1000mU/L的取S分别刺激VSMC3、6、12、24小时后, 可诱导COX一2的基因和蛋白表达、并刺激VSMC合成PGEZ、均表现出时效和 量效关系(p0.01);阿司匹林(100林M和400林M)和NS一398(10林M和100林M) 对COX一2蛋白表达无明显影响(P0.05);pD98059(25林M)、SB203580(20林M)、 以及二者共同作用均使INs诱导的cOX一2蛋白表达明显减少(p0.01);INS刺 第二军医大学博士毕业论文 中文摘妥 激后引起活化的JNK蛋白表达,其时间窗口为15一120分钟。 4、pCMV-COX一2经脂质体转染后,EC在基因和蛋白水平均可表达COX一2; 转染后的EC表达ICAM一l明显增加(p0 .01),阿司匹林(100林M和400林M) 和Ns一398(10卜M和10即M)可以降低ICAM一l表达,NS一398的作用强于阿司 匹林(p0.05)。 结论: 1、高浓度INS通过激活细胞内MAPK信号通路刺激COX一2表达、进而产 生促AS作用。 2、COX一2参与了AS病理发生以及斑块易损化中的炎症反应过程,有望成 为抗AS、特别是稳定斑块治疗的新靶点。 3、选择性COX一2抑制剂能够降低炎症反应、对防治AS和急性冠脉事件具 有潜在的应用价值。


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