大鼠IgEFcCH2-3受体阻断与IgEFcCH2-3-FasL诱导肥大细胞凋亡的研究

【摘要】：第一部分 大鼠IgEFcCH2-3-FasL融合蛋白受体阻断和诱导肥大细胞凋亡防治哮喘的研究 目的 建立大鼠哮喘模型，获得哮喘大鼠的脾脏和外周血：构建pBAD／IgECH2-3原核表达质粒，研究大鼠IgE的Fc区CH2-3的生物学活性；明确大鼠肥大细胞表面Fas表达及其功能；构建真核表达质粒pcDNA3.1／FasL，并观察FasL基因转染对RBL-2H3的影响；构建真核表达质粒pcDNA3.1／IgEFcCH2-3-FasL，观察大鼠IgEFcCH2-3-FasL基因转染对RBL-2H3的影响。 方法 以鸡卵白蛋白为抗原，氢氧化铝为佐剂，腹腔内注射建立大鼠的哮喘模型；构建大鼠IgE的Fc区CH2-3的原核表达质粒pBAD／gⅢA／CH2-3，并转化入TOP10中，阿拉伯糖诱导表达、周质腔抽提、Ni-NTA金属鳌合柱纯化获得大鼠IgE的Fc区CH2-3，细胞及动物水平检测蛋白质生物学活性；培养RBL-2H3细胞株及分离大鼠腹腔肥大细胞，应用RT-PCR和免疫印迹法检测Fas的转录和表达，免疫细胞化学法定位；应用annexinV流式细胞仪检测经抗大鼠Fas多克隆抗体诱导RBL-2H3的凋亡情况；RT-PCR法扩增大鼠FasL穿膜区和胞外区cDNA，成功构建PCDNA3.1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3，RT-PCR、免疫印迹法鉴定FasL在RBL-2H3上的表达，Annexin V流式细胞检测pcDNA3.1／FasL转染RBL-2H3后细胞的凋亡情况：设计、合成引物，以多克隆位点为Linker，应用两次克隆法，PCR扩增IgECH2-3、FasL基因，先后连接于pcDNA3.1，转化大肠杆菌TOP10，双酶切、测序鉴定阳性质粒；将构建的真核表达质粒pcDNA3.1／IgECH2-3-FasL转染RBL-2H3，RT-PCR及免疫印迹法鉴定大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白的表达，Annexin V流式细胞分析融合蛋白对RBL-2H3的凋亡作用，通过组胺释放率的测定分析融合蛋白对RBL-2H3脱颗粒的阻断作用。 结果 免疫激发组大鼠在接受抗原激发后表现、肺泡灌洗液记数及病理均与哮喘大鼠符合；原核系统表达出大鼠IgE的Fc区CH2-3，它能够阻断OVA激发的RBL-2H3的脱颗粒反应，阻断被动皮肤实验；RT-PCR及免疫印迹证实肥大细胞有Fas蛋白的转录和表达，免疫细胞化学证实Fas表达于肥大细胞膜表面，annexinV流式细胞仪 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 检测发现在抗大鼠Fas多克隆抗体的诱导下RB卜2H3出现调亡;获得FasL穿膜区和 胞外区cDNA，构建PcDNA3.1/F asL真核表达质粒，瞬时转染RB卜2H3后在细胞膜和上 清均有FasL的存在，瞬时转染RB卜2H3后48小时，细胞发生凋亡:成功构建 IgECHZ一3一FasL融合蛋白的真核表达质粒，大鼠馆ECHZ一于FttsL以融合蛋白的形式在 RBL一2H3上获得表达，并且诱导RBL一2H3凋亡，部分阻断了RBLweZH3的脱颗粒。 结论大鼠哮喘模型的制备是成功的:大鼠IgE的Fc区口12一3能够封闭IgE 高亲和力受体，阻断过敏反应:大鼠肥大细胞表面表达几s，通过激活几s途径可诱 导肥大细胞凋亡:RBL一2H3可以通过Fas一FasL途径凋亡;大鼠19日资论一3干asL融合 蛋白具有促进肥大细胞凋亡和抑制肥大细胞脱颗粒的双重作用。 第二部分人Fc￡R IQ亚基的细胞外区的原核表达及其抗血清的制备和功能 目的获得有生物活性的Fc￡R IQ亚基细胞外区及其多克隆抗体，并探知其 功能。 方法构建Fc￡R IQ亚基的细胞外区的原核表达载体pBAD/glfl灯Fc!R IQ， 经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性。纯化制品免疫兔子获得抗血清，并研究抗 血清对Fc￡Rl的作用。 结果经原核表达出的Fc￡R IQ亚基的细胞外区能与I班结合;获得具有特 异性抗Fc￡Rl的抗血清，可能抑制嗜碱性粒细胞脱颗粒。 结论原核表达系统能产生有生物学活性的Fc￡R Ia亚基的细胞外区，用其 制备的抗血清能够识别Fc￡R工a亚基的细胞外区，可能抑制嗜碱性粒细胞脱颗粒， 为研究Fc￡Rl。表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质 基础。