核糖体S6激酶在大鼠肝纤维化发生中的作用

【摘要】：【研究背景及目的】 肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的共同路径，其病理特征表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常沉积。大量研究资料表明，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化时ECM的主要来源。HSC的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节。 目前研究表明，HSC的增殖和胶原合成与有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级链信号通路密切相关。MAPK通路是细胞内蛋白磷酸化信号传递系统的枢纽。真核细胞中存在三条经典的MAPK通路：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，Jun激酶(Jun kinase，JNK)通路和p38 MAPK通路。其中，ERK通路主要被生长因子、多肽类激素以及神经递质激活，控制着细胞增殖、分化、生存和凋亡，与多种脏器，例如肝脏、肾脏、肺以及胰腺的纤维化密切相关。 核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)，分子量约为90 kDa，隶属于生长因子活化的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，位于ERK基因下游，在多种细胞的生理及病理过程中发挥调节基因转录、细胞周期及维持细胞生存等作用，与多种慢性疾病及肿瘤的发生关系密切，但目前国内外尚无RSK与肝纤维化的相关性研究报道。 本研究的目的旨在通过Northern印迹、免疫组化、免疫荧光双标记-激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)成像等技术，研究RSK在纤维化肝组织中的表达、定位，以及与胶原表达和ERK信号通路的相关性，探讨RSK在肝纤维化发生中的作用，进一步明确和完善ERK信号通路与肝纤维化发生的关系。 【实验方法】 1、大鼠肝纤维化模型的构建 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，体重250-300g，随机分为正常对照组(n=15只)和模型组(n=30只)。模型组腹腔注射二甲基亚硝胺 第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 (dimethylnitrosamine，DMN)生理盐水溶液10 mg/kg，对照组腹腔注射等体积 生理盐水，每周连续注射3d，持续3周。分别于注射第1、2、3周末，取肝组 织标本，部分制成石蜡切片，行HE和VG染色;部分行RNA抽提，一80℃贮 存备用。 2、大鼠纤维化肝组织中RSK及I、IJI型胶原的表达 将抽提的大鼠肝组织RNA，按造模时段进行样本合并，行2%琼脂糖凝胶 电泳及核酸定量检测，以Norihem印迹检测不同时期纤维化肝组织中RSK的 mRNA变化;利用免疫组化SABC法检测相应的纤维化肝组织中RSK和I、m 胶原的表达，图像扫描半定量结果进行统计学分析。 3、RSK与ERK信号通路相关性研究 以*平滑肌肌动蛋白(a--smooth musele aetin，。SMA)作为活化的HsC的 定位标志，采用免疫荧光双标记一激光扫描共聚焦显微镜(l aser scanning confocal microscope，LsCM)成像技术，明确RSK在纤维化肝组织中的细胞定位，以及 与ERK和I型胶原之间的表达定位关系。 本实验室前期构建了针对ERKI基因RNA干扰的真核表达载体 (pAV‘ERKI 51洲A)，并转染Hse·T6(表型为活化的Hse株)，通过G4ls筛 选后建立稳定表达细胞株(Hsc一pAv-EI引KI siRNA)。本实验进一步利用免疫印 迹检测转染前后HSC一T6中ERK和RSK的表达变化。 【实验结果】 1、大鼠肝纤维化模型的建立 HE和VG染色显示，随着DMN注射时间的延长，肝细胞坏死及组织内纤 维沉积逐渐增加，至造模结束，肝组织中可见典型的假小叶形成。该模型病理改 变典型，病程时段区分明确。 2、RSK在大鼠肝纤维化不同时期的表达及其与I、m胶原的相关性 Northem印迹结果表明，随着DMN注射时间的延长，RSK的mRNA表达 较正常对照组进行性增加;图像灰度扫描半定量显示，DMN注射1、2、3周后， RSK的表达量分别较对照组增加了60%、80%和140%。 免疫组化染色结果显示，RSK在正常大鼠肝组织中仅有少量表达，分布在 中央静脉周围的肝血窦;在肝纤维化进程中，其表达量进行性增加，与I型、m 第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 型胶原的变化趋势一致。图像扫描半定量数据进行统计学相关和回归分析结果证 实，RSK与I型、nl型胶原的表达存在直线相关(p0.05)。 3、RSK与ERK相关性研究 LSCM成像结果显示，在正常肝组织中，RSK、ERK和a一SMA几乎无表达; 在纤维化肝组织中，三者表达量均明显增加，分布区域完全一致，提示在纤维化 肝组织中，RSK和ERK表达同步增高，且主要定位于活化的HSC中。 免疫印迹检测结果证实，RNA干扰后HSC一T6中ERK在蛋白水平表达较对 照组下降了72%，RSK同时下降了89%。 【结论】 1、在纤维化肝组织中，RSK与I、m胶原表达呈直线相关，提示RSK可 能参与胶原的表达调控。 2、在活化的HSC中，RSK与ERK变化一致，表明RSK介导了HSC中 ERK通路的信号传递。 3、ERK/RSK信号通路与肝纤维化的发生密切相关。 4、RSK可能成为治疗肝纤维化新的靶点。

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R575.2