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《第二军医大学》 2004年
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细胞内乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法的建立及应用

赵克开  
【摘要】:本研究分为三个部分:一、细胞内乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法的建立;二、氧化苦参碱对HepG 2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA含量的影响;三、慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞内cccDNA的检测。 一、细胞内乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法的建立 目的 建立细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法。方法 以HepG2.2.15细胞为模型,消化、收集处于对数生长期的细胞,取1×10~6个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量PCR检测。用对数生长期前的细胞培养上清、4份HBV DNA阳性和2份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光定量PCR法的特异性,并用不同浓度的质粒标准品检测该方法的敏感性。结果 证实HepG2.2.15细胞内存在cccDNA,在培养第7天的细胞内含量约为每个细胞18拷贝。对数生长期前培养上清和慢性乙肝(轻度)患者血清均未检测到荧光信号,本实验条件下用该方法可检测低至10~3拷贝/ml的cccDNA分子。结论 该方法可用于定量检测细胞内的乙型肝炎病毒cccDNA,操作方便,特异性高,敏感性较好。 二、氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA含量的影响 目的 观察氧化苦参碱能否抑制或清除感染细胞内的乙型肝炎病毒cccDNA,探讨其抗乙型肝炎病毒作用的可能机制。方法 将2×10~5/ml的HepG2.2.15细胞分别接种于75cm~2培养瓶,每瓶12ml。接种后48小时,换用含不同药物浓度的培养液,包括氧化苦参碱1000μg/ml组、氧化苦参碱500μg/ml组、
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R446.9

【参考文献】
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