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《第二军医大学》 2007年
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可注射式硫酸钙/纳米羟基磷灰石人工骨的研制及其生物学性能的初步研究

葛亮  
【摘要】: 研究背景 当前各种原因造成的难治性骨缺损是临床上面临的一大难题,为了避免传统的自体骨及同种异体骨移植所带来的问题,人们开发了许多种类的人工骨修复材料,时值今日,这一领域已成为创伤骨科和骨组织工程学研究的一个热点。以往人工骨材料在使用时,一般都要在体外预制成型,经过手术切开后植入体内,病人需承受手术创伤和因此带来的风险。近年来出现的可注射式人工骨材料克服了这一问题。在精确的手术定位下,注射材料只需微小的创伤即可到达骨缺损部位,在一定时间里固化并达到合适的机械强度,刺激新骨生成或为成骨细胞提供良好的支架,自身则在缺损修复过程中逐渐降解,不遗留不良后果。在某些特殊情况下,可注射式人工骨还可充当某些成骨因子或药物的控释载体,进一步提高修复效率。 羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是一种经典的骨修复材料,生物相容性和免疫原性都很理想,而纳米级羟基磷灰石(Nano-sized hydroxyapatite,n-HA)因其晶体尺径与人体骨矿中磷灰石相当,骨修复效果更佳。但羟基磷灰石的体内降解时间较长,且塑型性能很差,难以注射使用。而另一种具有悠久历史的成骨材料——硫酸钙,则在注射性和吸收性方面具有良好的表现。上世纪末期,经过半水结晶化改造的硫酸钙(Calcium sulphate hemihydrate,CSH)材料已在吸收速度、成骨效果和力学性能等多方面得到提高。将CSH与HA组合而成的复合材料,被发现可综合两物质的性能优势,是一种理想的注射式骨修复材料,在国外已引起很大兴趣。本课题试将n-HA取代普通HA与CSH材料进行复合。进行了以下方面的工作:⑴所用n-HA系自行合成,作者尝试不同反应条件以获得符合需要的纳米级HA晶体。对n-HA和CSH的复合过程中,着重探索了影响材料凝固时间、机械强度和注射性能的各项因素。⑵复合人工骨材料的生物安全性。⑶复合材料在体外浸泡环境下的变化;⑷材料在动物体内的生物相容性、降解性能和成骨能力。 方法 1.n-HA的合成及CSH/n-HA复合材料注射、凝固和机械性能的研究:采用湿法合成HA前驱体,水洗或醇洗后,20℃、30℃、40℃等温度下陈化24h,DMA或葡萄糖分散,超声处理3h,100℃水浴和140℃油浴后结晶。各组所获样品行FTIR红外光谱分析、PCS激光粒度分析和晶体TEM观察。设置三组复合材料样品(10%wtHA+CSH、20%wtHA+CSH和40%wtHA+CSH),测试不同液固比条件下复合材料的注射特性,25℃和37℃下分别测试不同液固比、不同固化液种类和不同二水硫酸钙促凝剂条件下的材料初、终凝时间和压缩强度,均与纯硫酸钙作对比。 2.复合材料的生物安全性研究:对40%wt n-HA/CSH人工骨进行急性全身毒性试验、皮内刺激试验、致敏试验和遗传毒性实验(Ames试验),对对CSH、n-HA和HA含量分别为10%wt、20%wt和40%wt之复合材料进行MTT细胞毒性试验,并与对照组比较。 3.复合材料在模拟体液浸泡下的体外实验研究:采用模拟人体体液SBF9#浸泡CSH、n-HA和HA含量分别为10%wt、20%wt和40%wt之复合材料等5种样品,测定其失重率、钙磷元素释放速率并对材料表面形态和晶体变化作SEM观察和XRD分析。 4.复合材料在动物体内的生物相容性、降解性和成骨性能研究:家兔背部肌肉内埋植颗粒状人工骨样品(20%wt n-HA/CSH),右侧股骨髁部钻孔缺损内注射20%wt n-HA/CSH人工骨,左侧空白对照。分别在术后5d及2、3、4、5、6、8、12周观察家兔的一般情况、复合材料的改变情况、肌肉组织病理和透射电镜表现,以及远端股骨不脱钙骨组织病理和影像学变化。 结果 1.湿法合成的n-HA红外图谱与人体骨接近,PCS分析表明HA平均粒径为65.9nm,粒度主要分布于40至120nm之间,与人骨磷灰石分布相近,PCS和TEM显示水洗、超声处理和加入分散剂后的晶体粒径分布更为均匀,140℃下结晶的n-HA较100℃下的更为粗大。复合材料以水作固化液,液固比0.50以上时注射性能满意。无论何种液/固比,复合材料的凝固时间均较硫酸钙延长,37℃下的凝固时间较25℃下延长。一定范围内促凝剂用量过大或过小均使凝固时间延长。液固比越大或促凝剂用量越高,材料压缩强度越低。纳米磷灰石含量增大则材料强度降低。 2.人工骨浸取液静脉及腹腔注射后不引起小鼠呼吸、进食改变或死亡,体重稳定。家兔皮内注射72小时后仅出现红斑或微弱水肿,豚鼠皮内注射后未出现过敏反应。MTT细胞毒性试验显示含HA10%、20%、40%人工骨及纯n-HA、CSH的细胞增殖率均在77%以上,细胞毒性均为0~1级,Ames试验表明含HA 40%人工骨的不同浓度生理盐水浸取液引起鼠伤寒沙门氏菌回复突变数均不超过阴性对照组的2倍。 3.SBF9#溶液浸泡2周后,纯羟基磷灰石在早期快速失重后保持稳定,其余材料均稳定降解,复合材料的HA含量越高,降解速率越快。纳米羟基磷灰石组的溶液Ca浓度始终较低;各组均有P元素释出,但随时间减少。XRD分析发现复合材料浸泡中CS峰下降,HA峰强度增高。扫描电镜观察到浸泡后复合材料表面呈现新的晶体形态。 4.20%wt n-HA/CSH复合材料在家兔体内埋植后无全身反应,局部肌肉组织早期出现炎症反应,无感染、坏死。材料在肌肉内以分层方式降解,TEM显示该降解由细胞吞噬反应所介导,吞噬降解过程中不出现中毒反应和细胞损害。材料在背部肌肉内6~8周完全降解,骨内8~12周完全降解,不遗留任何纤维化、异位骨化和瘤样变。松质骨内6周出现明显新生骨形成,8-12周完全修复缺损,与对照组差异明显。 结论 1.成功合成了纳米级羟基磷灰石晶体,尺径与人体骨接近。合理掌握n-HA的比例,液固比和促凝剂的用量,是开发n-HA/CSH复合人工骨的关键。 2.n-HA/CSH复合材料不引起全身毒性反应、皮内刺激反应和急性过敏反应。且无MTT细胞毒性,细胞相容性良好。同时,复合材料的生理盐水浸取液不引起鼠伤寒沙门氏菌回复突变数增加。 3.CSD与HA在SBF环境下可能出现表面Ca、P的释放-吸附动态过程,材料的降解速度主要取决于CSD,可通过调节成分配比而加以控制。 4.n-HA/CSH人工骨生物相容性良好,动物体内降解速度符合骨再生需要,且可调节,不仅具备很好的成骨活性,且有望充当药物治疗的控释载体。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R318.17

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【引证文献】
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8 杨明;纳米羟基磷灰石/聚乳酸可吸收椎间融合器的生物力学研究[D];中南大学;2009年
9 袁华;天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料修复骨缺损的实验研究[D];南京医科大学;2005年
10 赵彦涛;几种纳米羟基磷灰石材料的合成与生物相容性研究[D];第四军医大学;2006年
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