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《第二军医大学》 2007年
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CBP基因在肺癌中的表达及其转染对肺腺癌SPC-A-1细胞体外生长的抑制作用

周栋  
【摘要】: Src羧基末端激酶结合蛋白( csk-binding protein,CBP)是2000年发现报道的新基因,目前认为CBP通过对Src家族成员激酶活性的负反馈调节以及对免疫细胞激活过程的负调节和肿瘤的发生、发展相关联。CBP的发现,为Src激酶家族在细胞中的正确定位提供了良好的解释,为肿瘤的分子机理研究提供了新的思路。目前关于CBP基因与人类肺癌发生、发展关系的研究国内外尚未见报道。目的:比较分析CBP基因mRNA和蛋白在人肺癌组织中的表达情况,通过基因重组技术构建CBP基因真核表达载体,将其转染人肺腺癌细胞株SPC-A-1,观察重组表达载体对SPC-A-1细胞生物学行为的影响。探寻CBP基因在肺腺癌SPC-A-1发生、发展中的作用,从而为肺腺癌机理研究和基因治疗方面提供新的思路和理论依据。方法:(1)RT-PCR及Western-blot方法检测肺癌组织与对应癌旁正常肺组织中CBP基因mRNA和蛋白的表达量,并探寻表达差异与临床病理的相关性。(2)提取SPC-A-1细胞总RNA,根据人CBP基因序列设计引物,应用RT-PCR法扩增目的片断,通过双酶切定向克隆的方法构建CBP基因真核表达载体pcDNA3.0-CBP。(3)应用脂质体(Lipofectamine2000)将重组表达载体导入SPC-A-1细胞, G418筛选阳性克隆, PCR鉴定转染结果。应用RT-PCR及Western-blot法检测转染前后细胞CBP基因mRNA和蛋白表达差异。(4)通过MTT比色、软琼脂集落形成、划痕修复、Transwell细胞运动和Transwell细胞侵袭等一系列细胞功能学实验,观察稳定转染细胞株CBP的差异表达对肿瘤细胞增殖、粘附、运动和侵袭的影响。结果:(1)人肺癌组织中CBP基因mRNA和蛋白表达量显著低于癌旁正常肺组织。CBP下调表达与肿瘤的TNM分期及淋巴结转移(P0.05)相关,与肺癌组织学类型、细胞分化程度以及患者的性别、年龄无关。(2)经过筛选、酶切以及测序鉴定,证实成功构建CBP基因真核表达载体pcDNA3.0-CBP。(3)经脂质体转染及G418筛选,重组体组及空载体组均有阳性克隆形成,用PCR法证实两种载体均成功整合到受体细胞基因组DNA中。重组体转染组细胞中CBP基因mRNA和蛋白表达量较空载体转染组和未转染组上调。(4)对转染前后的肿瘤细胞观察表明,重组体转染组细胞生长减慢,克隆形成率降低,细胞迁移、运动能力和侵袭能力降低。结论:(1)与癌旁正常肺组织相比,人肺癌组织中CBP基因低表达。(2)成功构建了CBP基因的真核表达载体。(3)应用脂质体转染法成功将CBP基因的真核表达载体导入SPC-A-1细胞,真核表达载体显著上调了CBP基因mRNA和蛋白的表达。(4)CBP基因真核表达载体能够显著抑制肺腺癌SPC-A-1细胞增殖,降低肿瘤细胞对周围组织的侵袭作用。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R734.2

【引证文献】
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