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《第二军医大学》 2007年
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小肠粘膜边缘群细胞治疗大鼠短肠综合征的实验研究

王震龙  
【摘要】: 随着全肠外营养支持(TPN)和家庭肠外营养支持(HPN)治疗的进步,不少因短肠综合征而导致肠功能衰竭的患者已经能够获得较为满意的生活质量。但是终究无法摆脱严重的、甚至致命的并发症的威胁,如导管感染、严重的胆汁淤积和慢性继发性肝病等。当肠衰竭患者合并有不可逆性肝损伤时就需要进行肝-肠联合移植。尽管小肠移植的生存率在逐年提高,随着新的免疫抑制剂的应用,小肠移植的病人一年生存率已与肝脏移植病人接近。但供体的缺乏等因素,仍然是目前很难解决的问题。使肠蠕动速度减慢的手术方式不符合生理,效果不满意,能获益者甚少,甚至是有害无益。 位于隐窝底部潘氏细胞之上的未分化细胞,是能够分化出小肠粘膜成熟上皮细胞的多能干细胞。正是小肠粘膜干细胞的各种特性维持着小肠粘膜的完整性及小肠粘膜细胞的不断周期性更新。小肠粘膜干细胞的研究已经有三十多年的历史。目前多数研究认为小肠粘膜类器官片段来源的小肠边缘群(side-population,SP)细胞是能够干细胞的细胞群体,本研究目的在于分析大鼠小肠粘膜SP细胞的生物学特性,并进一步探索其在短肠综合征大鼠的移植治疗作用。 第一部分:大鼠胎鼠小肠粘膜边缘群细胞生物学特性研究 目的:分离边缘群(side population,SP)细胞是富集干细胞的有效技术手段,近期实验证实小鼠来源的小肠粘膜SP细胞富集小肠粘膜干细胞。本研究目的在于分析大鼠来源的SP细胞生物学特性,为小肠粘膜SP细胞在大鼠模型中的应用提供实验依据。 方法:取Wistar大鼠胎鼠小肠全长,按文献方法制作小肠粘膜的类器官片段并制备成单细胞悬液。使用Hoechst33342和PI (Propidium iodide)染色后用流式细胞仪分选SP细胞。提取分选前后的细胞总RNA和蛋白,用实时定量PCR及Western-blot方法分别检测其中Musashi-1mRNA及Musashi-1蛋白的表达水平。结果:流式细胞分选仪图形显示大鼠胎鼠来源的小肠粘膜单细胞悬液的细胞群图形呈“鸟嘴样”,且染色液中加入维拉帕米后“鸟嘴”部分即SP细胞群消失。定量PCR及Western-blot检测显示SP细胞中Musashi-1mRNA含量是分选前细胞的8.125倍,是非SP细胞的20.077倍。Western-blot结果显示Musashi-1蛋白水平明显高于分选前。 结论:大鼠胎鼠的SP细胞富集小肠粘膜干细胞,与小鼠来源的SP细胞生物学特性基本一致。 第二部分:移植小肠粘膜边缘群细胞治疗大鼠短肠综合征的实验研究 目的:观察移植小肠粘膜SP细胞对短肠综合征大鼠的治疗作用。方法:Wistar大鼠切除75%小肠后随机分成实验组(n=9)和对照组(n=11)。手术后第五天所有大鼠给予全身照射(300cGy),照射后24小时内实验组在显微镜下将5×105小肠粘膜SP细胞注射到大鼠小肠粘膜下,对照组注射同样体积的1×HBSS。每日称量大鼠体重,移植四个月后检测木糖吸收实验、氮平衡实验、脂肪平衡实验,处死大鼠后测定小肠长度、湿重、面积,并行组织学检测,统计绒毛高度、隐窝深度及绒毛密度。 结果:移植四个月后,实验组大鼠体重及移植后增长体重(280±23g,122±25g)明显均高于对照组(252±21g,98±23g)(P0.05)。实验组小肠长度(39.0±9.8cm)明显高于对照组(26.5±6.7cm)(P0.01);实验组的木糖吸收率(0.17±0.07%)明显高于对照组(0.10±0.04%)(P0.05);实验组和对照组脂肪吸收率分别为0.98±0.01%和0.86±0.08%,实验组明显高于对照组(P0.05)。实验组和对照组氮总利用率分别为0.53%±0.14%和0.38%±0.17%,实验组明显高于对照组(P0.05)。 结论:移植小肠粘膜SP细胞能够增加小肠的吸收面积和吸收能力。 第三部分:稳定性同位素示踪法检测移植小肠粘膜SP细胞后小肠吸收能力的变化 目的:本研究目的在于检测移植小肠粘膜SP细胞后的大鼠对同位素标记的氨基酸吸收能力的变化,研究移植后大鼠小肠吸收能力的变化。 方法:实验组、对照组和正常组大鼠,用15N标记的亮氨酸(0.25g/kg)灌胃,在灌胃后15分钟、0.5h、1h、2h抽血,测定各血清标本中的15N—Leucine丰度。根据不同时间15N—Leucine在血清中的丰值绘制吸收曲线。通过15N—Leucine在血中丰度的峰值和丰度时相曲线下面积判断15N—Leucine的吸收情况。 结果:实验组与对照组均在半小时达到吸收高峰,实验组吸收曲线下面积为正常组的70%,对照线吸收曲线下面积为正常组37%。实验组明显高于对照组(P0.01)。 结论:小肠粘膜SP细胞移植能增强短肠大鼠对氨基酸吸收能力。 第四部分:地高辛标记的原位杂交法检测供体细胞在受体小肠内分布 目的:应用地高辛标记的原位杂交方法,检测雄性大鼠的小肠粘膜SP细胞在受体小肠内的分布增殖情况。 方法:大鼠麻醉后处死,取小肠制备12μm切片,进行原位杂交检测。结果:在移植组的大鼠小肠标本中,显著增生部位的隐窝及绒毛部位均能检测到细胞核中Y染色体存在的标志供者来源细胞。 结论:结果证明供体来源的细胞能较长时间在受体小肠内生存并参与小肠粘膜的修复与再生,结合前面的研究结果,表明小肠粘膜SP细胞移植对短肠综合征大鼠治疗有重要意义。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R574

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