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《第二军医大学》 2007年
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海洋微生物Ⅰ型PKS基因资源的筛选与鉴定

董晓毅  
【摘要】: 海洋是一个极其复杂的生态大系统,孕育了丰富的微生物基因资源。使用传统的微生物分离培养方法,建立海洋微生物种质基因库十分必要,但无疑杯水车薪,因为占环境微生物总量99%的属于未获得培养的微生物,对这些微生物种群的研究只能另辟蹊径。依靠目前成熟的基因工程技术,从海洋生境中直接分离、克隆和表达有用的海洋微生物功能基因,是非常实际的选择。其中,合成红霉素、雷帕霉素和埃博霉素等具有医学治疗价值的次级代谢产物的Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因很适合作为宏基因组功能基因筛选目标。 目前国际通用的技术路线是直接提取某种环境中的总DNA,构建环境宏基因组文库,使用杂交或PCR方法从中筛选含Ⅰ型PKS基因的阳性克隆,再对其进行测序得到目的基因序列。目前最典型的工作就是从土壤宏基因组文库中筛选Ⅰ型PKS基因。在海洋宏基因组研究领域,目前已经在可产生已知聚酮类化合物的海绵、总草苔虫等海洋无脊椎动物的共生微生物宏基因组文库中筛选到了一些Ⅰ型PKS基因。 本研究以能生物合成聚酮类化合物的Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)基因作为研究对象,设计了一套针对Ⅰ型PKS基因中保守序列的简并引物,对我国东海海域的沿岸土壤、海水、海洋沉积物等不同生境以及可产生聚酮类化合物的海洋细菌进行Ⅰ型PKS基因的筛选鉴定以及功能分析,希望能获得一批Ⅰ型PKS基因片段,为今后开发海洋来源的新型聚酮类抗肿瘤药物打下工作基础。 一、东海不同生境总基因组DNA的提取 采集我国东海洋山港沿岸土壤样本、海水和海底沉积物等不同生境样本以及各种微生物样本,针对不同样本使用了不同方法以及商品化试剂盒提取其总DNA,试用16 s rDNA通用引物以及分光光度法进行质量鉴定,比较其提取得率和纯度,从中选取最适合该样本的DNA提取方法用于下一步研究。 二、简并引物设计以及有效性验证 从GenBank中查找已知PKS基因的保守序列,使用网上CODEHOP简并引物设计服务,结合Primer Premier 5和DNAMAN等生物学软件,已经设计出针对Ⅰ型PKS基因保守区域KS片段的简并引物一套:其中正义引物针对PQQR模序,共32条,序列为: 5- CGC TCC ATG GAY CCS CAR CA -3’反义引物则针对HGTGT模序,共24条,序列为: 5-- GTS CCS GTS SCR TGS SHY TCS A -3’ 在含Ⅰ型PKS基因的游动束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum,产生大环内酰胺抗生素Ansamitocin)和Strentomyces avermitili(s产生阿维菌素Avermectin)上验证了其有效性,从两种放线菌的基因组DNA中均扩增出了长约700 bp的目的片断,将其连接到PMD-18 T载体上测序,测序结果经BLASTN比对,完全正确。 三、东海洋山港沿岸土壤、海水以及海底沉积物样本中Ⅰ型PKS筛选鉴定与功能分析 试用Mobio公司的基于玻璃珠与蛋白酶K消化方法的土壤基因组提取试剂盒,从东海沿岸土壤中和海水中提取了高质量的基因组DNA,使用前面设计验证过的兼并引物进行PCR扩增。反应体系:2.5μl 10×buffer,4μl dNTP(2.5 mmol/L),正义引物与反义引物各0.25μl(40μmmol/L),1μl模板DNA,0.25μl Taq Ex(5U/μl,Takara),双蒸水补足反应体系。反应条件:94℃预变性5 min;94℃,1 min;63℃,1 min;72℃,2 min;35个循环;72℃延伸10 min。将PCR阳性条带胶回收后,克隆到PMD18-T载体上,转化大肠杆菌BL21,将筛选得到的阳性克隆子送样到上海英骏生物技术有限公司用3730测序仪进行序列测定。将得到的目标片段序列提交GenBANK数据库,采用网上BLAST程序进行序列的同源性分析。使用CLUSTAL X软件和PHYLIP软件包进行序列比对和功能分析。 从不同生境中获得了23条I型PKS基因的KS序列片段,其中土壤来源的19个,海水来源的4个,长度从630 bp到690 bp不等。GenBANK序列号为:DQ640993 , DQ640997 , DQ641926 , DQ641927 ; DQ673137-DQ673152 ;EF554859-EF554861。 将其与已知的PKS酮缩合酶基因片段进行BLAST比对,所获得的23条的核苷酸序列BLAST得分大部分在40-150之间,与Genbank中已有序列同源性很低,提示其来源于新物种;而所推断的氨基酸序列保守,BLAST比对直接提示其归属于PKS的KS片段,负责聚酮类化合物生物合成过程中的酮缩合反应。用CLUSTAL X和PHYLIP软件对所获序列与GenBank中已知功能的KS片段进行分子进化分析和功能比对,结果发现:发现DQ640997;DQ673137,DQ673138;DQ673140;DQ673142;DQ673144;DQ673145;DQ673149;DQ673151核心保守序列为VQTACSTS,结合其上游的N(DE)KD序列排布方式,提示这些KS片段可能来源于PKS/NRPS杂和基因簇,参与杂和的聚酮/非核糖体多肽类化合物的合成。 四、产Macrolactins的海洋细菌X-2中I型PKS基因的筛选鉴定与功能分析 Macrolactins是近年来从海洋微生物中分离的一群具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及抑制胆固醇合成活性的大环内酯类化合物。其生物合成基因簇迄今仍未有报道。 本室从东海海泥中分离到一株海洋细菌X-2,可产生多种Macrolactins。从Macrolactins的化学结构分析,其属于典型的大环内酯类化合物,其生物合成基因簇应为典型的Ⅰ型PKS基因簇。利用现有对于Ⅰ型PKS基因簇的认识,可对Macrolactins的生物合成基因簇的构成作出预测,本研究构建了该细菌的fosmid基因组文库,以扩增出的KS结构域的DNA片段(GenBank accessing number: EF486351)做探针筛选文库,克隆并鉴定了该细菌中可能为Macrolactins生物合成负责的部分Ⅰ型PKS基因。 总之,本研究使用简并引物扩增的方法,设计了一套针对Ⅰ型PKS基因中保守序列的简并引物,对我国东海海域的沿岸土壤、海水、海洋沉积物等不同生境以及产聚酮类化合物的海洋细菌中的Ⅰ型PKS基因的进行了初步的筛选鉴定和功能分析工作,获得了相当数量的新型Ⅰ型PKS基因,进行了初步的功能分析。研究结果从一个侧面揭示了PKS基因在海洋不同生境和微生物中的广泛分布状况,已经获得的序列不仅可作为探针,用于后期海洋宏基因组文库中PKS阳性克隆的筛选,还可直接用于后期新型聚酮类化合物的异源表达及生物合成研究。本研究最终将为我国海洋微生物功能基因资源开发利用和人民身体健康作出巨大贡献。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q93

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【引证文献】
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