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《第二军医大学》 2007年
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通过原位移植建立人肿瘤裸鼠转移模型建立高转移细胞株

夏一忠  
【摘要】: 恶性肿瘤浸润生长和远处转移是晚期肿瘤的重要特征,近1/3的肿瘤患者首诊时已属晚期,40%的患者术后复发或转移,预后不良。筛选和鉴定肿瘤转移相关基因,建立一套转移生物学标志,用于早期发现肿瘤转移对降低肿瘤死亡率具有重要意义;而建立遗传背景相同的高、低转移细胞株是寻找和筛选转移相关基因的基础和关键。 目的 本研究通过3部分的实验:一、原位移植建立人肿瘤裸鼠转移模型;二、体内外连续筛选建立高转移人肿瘤细胞亚系;三、人肿瘤不同转移潜能单克隆细胞株的建立及其生物学特性,从中寻找和筛选转移相关基因,建立一套转移生物学标志,来用于早期发现肿瘤转移。 方法 一、原位移植建立人肿瘤裸鼠转移模型 收集体外培养的对数生长期786-0细胞,进行裸鼠皮下注射,待皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出,以相同方法进行鼠间传代(每代2只),3~4代后取出移植瘤,剪成1mm3大小进行肾包膜下原位接种,获人肿瘤裸鼠转移模型,即外科原位移植(Surgical Orthotopic Implantation,SOI)模型,裸鼠垂死时脱颈处死,取出肺脏转移灶体外培养,胰酶消化传代4~5次后即获得较纯的肿瘤细胞,命名为786-0LM1。同时采用786-0细胞悬液进行肾包膜下原位注射,建立细胞原位注射(Cellular Orthotopic Injection,COI)模型,肺脏未见转移灶。 二、体内外连续筛选建立高转移细胞亚系 肿瘤转移异质性理论认为在肿瘤组织中存在着具有不同侵袭、转移能力的细胞亚群,而只有那些具有能完成侵袭转移全过程能力(黏附能力、蛋白水解能力、细胞游走能力)的瘤细胞才能最终形成转移灶。因此可依据某些侵袭、转移有关因素的表达与否筛选出具有不同侵袭转移能力的瘤细胞。 Matrigel是一种从Engelborth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。主要由:层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素糖蛋白(类肝素蛋白多糖)、纤维连接蛋白、巢蛋白等组成。室温下Matrigel聚合成一种具有生物学活性的基质材料,在聚碳酯膜上形成一胶冻状物,封闭聚碳酯膜膜上的小孔,作用与哺乳动物细胞基底膜类似,只有那些具有蛋白水解能力的肿瘤细胞才能穿过Matrigel和聚碳酯膜上的小孔;无蛋白水解能力的非侵袭性细胞不能穿过,收集和扩增穿透侵袭膜背面以及掉到Transwell下室的细胞具有较强的侵袭性。因此Matrigel可用于体外分离侵袭性和非侵袭性肿瘤细胞。 本研究应用Matrigel和Transwell Insert构建侵袭小室,基本过程是:Matrigel均匀铺在Transwell Insert的聚碳酯膜上(含8μm的小孔),下室加入趋化剂(无血清培养的NIH3T3上清),无血清1640悬浮的786-0LM1细胞105个/孔加入上室,37℃,5%CO2条件下孵育72小时后,收集穿过Matrigel的肿瘤细胞扩增培养,进行第二轮裸鼠体内筛选:裸鼠皮下接种细胞悬液,获得皮下移植瘤进行肾包膜下原位接种。如此重复共进行3轮体内外筛选。 三、人肿瘤高、低转移克隆株的建立及其生物学特性 本实验采用有限稀释法将高转移细胞亚系786-0LM3第10代细胞进行克隆化培养,并接种棵鼠筛选不同转移潜能的克隆株,发现第5(NO. 5)和第8(NO.8)克隆株转移能力差别最大,裸鼠肾包膜下接种瘤组织5周后,肺转移率分别为100%(10/10)和20%(2/10),分别命名为786-0H、786-0L。采用体外侵袭实验、染色体分析、软琼脂培养及裸鼠体内成瘤和转移实验研究发现:两细胞株的生物学特性明显不同。采用细胞免疫化学S-P法检测两细胞株表达肿瘤侵袭、转移相关的基因MMP-2、MMP-9、PCNA、NM23的差异。结果表明:786-0H表达MMP-2、MMP-9、PCNA均呈强阳性,786-0L呈弱阳性表达。 结果 一、SOI模型的成瘤率和转移率均高于COI模型。 二、体外培养第3轮筛选获得的肺转移灶得到高系786-0LM3。 三、两细胞株表达NM23无明显不同(均为阳性)。 结论 一、成功地建立了人肾透明细胞癌细胞系786-0裸鼠SOI模型,为探讨肾透明细胞癌的转移机制提供了良好的动物模型。 二、证明了肿瘤的异质性不仅存在于肿瘤组织中而且存在于细胞系中;肿瘤的异质性是转移的根本原因,体内外连续筛选是分离转移细胞、优化转移模型的有效途径 三、由于遗传背景相同,其转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因结构或功能的差异,是mRNA差异显示技术克隆肿瘤转移相关基因,探讨肿瘤转移机制的理想材料。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R73-3

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