收藏本站
《第二军医大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

大、小鼠卵泡培养方法及其在雌性生殖毒性研究中的应用

万旭英  
【摘要】: 生殖和发育功能障碍是当前严重影响人体健康的主要公共卫生问题之一。外源性化学物作用于雌性生殖系统可以导致卵巢周期紊乱或不育,致使人群中自发性流产率、子代发育异常、生育力下降等显著增加。同时,雌性所有的配子在出生前就已经形成,出生时卵泡的数量是固定的,如果破坏了,无额外的配子补偿,后果较雄性更严重。因此,筛选和鉴定具有雌性生殖毒性的化学物,阐明其毒作用机制,对防治化学物引起的生殖系统危害具有重要意义。 近年来由于组合化学、计算机辅助药物设计等的快速发展带来新化学物的快速增长,现有毒理学评价方法已远远不能满足化学物快速增长的需求。因此,国际上的发展趋势是在方法学上要求发展符合“4R”原则(替代、减少、优化和可靠性)、具有高通量、所需受试样品量少的试验方法。目前雌性生殖毒性评价方法主要采用体内试验,存在的主要问题是整体动物实验不敏感、周期长、所需受试样品量多。体内试验难以揭示毒作用位点和毒作用机制。为此,近几年国内外已经建立了多种体外雌性生殖毒性试验方法,包括卵巢器官和卵巢皮质薄片培养方法和大鼠颗粒细胞和黄体细胞体外毒性试验方法。但这些体外方法无法对卵泡发育和卵子生成做出客观评价,而这应是雌性生殖毒性研究的关键所在。因此,迫切需要发展既能快速检测雌性生殖毒性又能更好地研究其作用机制的新方法。 卵泡体外培养方法是近年来发展的将早期卵泡不成熟卵母细胞(GV期或GV前期)在体外发育到可正常受精的成熟卵母细胞(MⅡ)的方法。由于该方法能对卵巢的主要功能即卵泡发育、激素生成和卵子发生进行动态观察,可在卵泡不同发育阶段对卵泡每一组分进行分析,因此受到生殖生物学和生殖毒理学界的关注。目前国外已经成功建立或基本建立绵羊、猪、小鼠腔前卵泡体外培养模型,并已应用于生殖生物学和生理学对卵泡发育和调控的研究。已有学者尝试将小鼠模型用于生殖毒性研究,但尚未发展成为毒性试验系统。有关大鼠腔前卵泡体外研究极少,仅见大鼠卵泡体外短期阶段性培养的个别研究,目前国内外尚未见类似小鼠可比较完整地观察大鼠卵泡发育过程和卵子形成的体外培养系统的报道。 本研究拟借鉴国外的经验,首先建立小鼠腔前卵泡体外培养方法,在此基础上尝试建立大鼠腔前卵泡的体外培养方法;然后选择已知卵巢毒物探讨大小鼠腔前卵泡体外培养方法用于雌性生殖毒物鉴定和机制研究的可行性,目的是为建立一个既可对雌性生殖毒物进行筛选或鉴定,又可对生殖毒作用机制进行研究的体外毒性试验系统提供依据。 一、小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立 采用机械性方法分离出生后(post-natal day,PND)PND12~14(C5781/6JxCBA/Ca)小鼠卵巢内直径为100~130μm的腔前卵泡,96孔板单个卵泡在石蜡油覆盖的M1培养基内连续培养12d后诱导排卵16h,观察卵泡发育、激素分泌和卵子形成,并将体外卵母细胞的成熟情况与体内卵母细胞的生长情况(in vivo growth and in vitromaturation of oocytes,IVM)进行比较,以判断体外培养方法是否成功。 1.小鼠卵泡体外发育特征 7只小鼠分离出419个卵泡,机械性分离完整卵泡率为376/419(89.74%),卵泡和卵母细胞直径分别从118.51±10.40μm和50.75±1.67μm增加到培养d12的452.03±110.25μm和69.54±1.55μm;培养d12卵泡存活率为86.87%(364/419),有腔形成率为31.03%(130/419);诱导排卵后COCs排出率为50.60%(212/419)。 小鼠卵泡体外发育形态学变化:体外培养的部分卵泡经历从腔前卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘细胞—卵母细胞复合体(COCs)排出、卵母细胞成熟和极体排出的形态学变化,也有部分卵泡不发生腔样结构改变,在卵泡中央可见卵丘—卵母细胞复合体,周围颗粒细胞平铺在培养板上,间隙不明显。 2.小鼠卵泡体外激素分泌的变化 收集d10、d12、d13更换的培养基测定卵泡激素P,每个时间点收集1-3个样品;收集d4、6、8、10、12更换的培养基测定卵泡激素E_2。E_2和P的检测采用磁性酶联免疫法,E_2抗体用17β-oestradiol,质控管在600~900pg/ml;P质控管在7~13ng/ml。体外培养卵泡从d4天开始检测到E_2增加,并且随着培养时间延长持续增加,d10~12维持在较高水平;d12诱导排卵刺激后P分泌量急剧增加,体外培养卵泡分泌E_2和P激素与体内分泌特征一致。 3.小鼠卵母细胞体外成熟 研究结果显示,IVG组4.61%(10/217)卵母细胞不能恢复成熟(停止在GV期),76.50%(166/217)停止减数分裂在GVBD期,18.89%(41/217)卵泡发出PB;而IVM组1.24%(3/241)的卵母细胞不能恢复成熟(停止在GV期),45.23%(109/241)停止减数分裂在GVBD,53.53%(41/241)卵泡发出PB;能完全成熟过渡到MⅡ期(PB排出)卵母细胞的比例在各个试验组之间有差异;没有一个卵母细胞完全发育成染色体不分离的超倍体。 综上可见,从卵泡发育、激素合成和卵母细胞成熟三方面显示本研究建立的小鼠腔前卵泡体外培养方法基本是成功的,与国内上海计生所汪玉宝等报道实验结果基本一致,但本研究卵母细胞PB形成率低于国外Sun F等微滴三维培养结果,有待进一步优化和完善培养体系。 二、大鼠腔前卵泡体外培养方法的建立 1.大鼠卵泡体外培养条件的确定 (1)不同大小卵泡培养效果的比较:分别收集了直径为100~130μm,131~150μm,151~160μm卵泡在体外培养11d,观察卵泡发育情况,结果表明:100~130μm大小的卵泡在培养dll有腔卵泡形成率、卵泡存活率、COCs排出率和成熟阶段卵母细胞明显较131~150μm组和151~160μm组减少,差异有统计学意义(P<0.05),而131~150μm组和151~160μm组之间无显著性差异。因此选择直径为131~150μm大小的腔前卵泡进行体外培养比较合适。 (2)不同鼠龄分离出的不同大小卵泡比例的差异:采用机械性分离不同大鼠鼠龄的卵泡,直径为130~150μm卵泡在不同鼠龄中所占比重存在差异:PND13所占比例最大,约94.87%,PND12和PND14分别为17.54%和小于29.58%。 (3)诱导起始排卵时间的选择:分别于d10、d11、d12诱导卵泡排卵后观察COCs的排出,结果显示这三个时间点COCs的排出率无显著性差异(P>0.05),因此d10、d11、d12都可以作为诱导卵泡排卵的时间。 (4)COCs排出观察时间的确定:大鼠卵泡在培养d11诱导排卵刺激16~22h观察COCs的排出情况,结果显示COCs排出率随着时间延长而增加,诱导刺激后20hCOCs排出率最高,达47.84%,因此选择大鼠卵泡COCs排出的观察时间为20h。 (5)每组卵泡数的确定:鉴于各观察指标的变异情况与小鼠卵泡培养的结果近似,故参照国外Val'erie Van Merris等报告结果,确定每组卵泡样本数为16~20个。 2.大鼠卵泡体外发育特征 4只PND13 SD大鼠共分离出296个腔前卵泡。机械性分离完整卵泡率为96.28%(285/296),卵泡和卵母细胞直径分别从141.26±8.82μm和51.25±1.37μm增加到培养dayll 543.21±131.11μm和70.48±2.89μm,培养d11卵泡存活率为92.23%(273/296),d6有腔形成率为67.91%(201/296),d11有腔形成率为75.67%(224/296),COCs排出率为44.93%(133/296)。 大鼠卵泡体外发育形态学变化:体外培养大鼠卵泡形态学上经历了腔前卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘细胞—卵母细胞复合体(COCs)排出、卵母细胞成熟和极体排出的形态学变化,与体内卵泡发育特征一致。 3.大鼠卵泡体外激素分泌情况 收集D4、6、8、10、12更换的培养基测定卵泡激素E_2;D10、D12、D13更换的培养基测定卵泡激素P,每个时间点收集1-3个样品。E_2和P的检测采用磁性酶联免疫法,E_2抗体用17β-oestradiol,质控管在600~900pg/ml;P质控管在7~13ng/ml。体外培养卵泡从d4天开始检测到E_2增加,并且随着培养时间延长持续增加,d8~11维持在较高水平;d11诱导排卵刺激后P分泌量急剧增加。体外培养卵泡分泌E_2和P激素与体内卵泡激素分泌特征一致。 4.大鼠卵母细胞体外成熟 研究显示,IVG组7.44%(9/121)卵母细胞不能恢复成熟,停止在GV期,57.02%(69/121)停止减数分裂在GVBD期,35.53%(43/121)卵泡发出PB,而IVM组1.86%(6/322)的卵母细胞不能恢复成熟,停止在GV期,40.06%(129/322)停止在减数分裂GVBD期,56.21%(181/322)卵泡发出PB;没有一个卵母细胞完全发育成染色体不分离的超倍体。 从卵泡发育、激素合成和卵母细胞成熟三方面以及参照小鼠培养方法的判断方法,显示本研究建立的大鼠腔前卵泡体外培养方法是成功的。 三、大鼠卵泡体外方法作为毒性检测系统的初步验证 由于本研究建立的小鼠卵泡体外培养方法在卵母细胞PB形成率上尚达不到国外水平,有待改进。另一方面,本研究建立的大鼠体外卵泡培养方法多项指标明显较小鼠卵泡培养效果好,加上大鼠是生殖毒性实验中最常使用的动物。因此,本研究在目前的条件下首先选择大鼠卵泡体外培养方法用于化学物雌性生殖毒性及其机制的研究。 本研究选择氯化镉、DEHP、MEHP和噻氨酯哒唑Nocodazole四种卵巢毒物,根据受试物作用特征,观察其对大鼠卵泡的体外毒性。 1.氯化镉 镉是一种常见的工业毒物和环境污染物,动物实验表明镉可干扰卵巢内分泌功能,使大鼠动情周期延长,卵巢组织形态结构发生改变;可以抑制卵泡的正常生长发育,抑制雌性动物排卵,造成暂时性不育;可以通过促使体内颗粒细胞凋亡而诱导卵泡闭锁,进而对卵母细胞的成熟、排卵等造成影响。体外实验表明氯化镉可以抑制大鼠颗粒细胞孕酮的合成。本研究从氯化镉对卵泡发育、激素合成和不同发育阶段卵泡的影响三个方面研究氯化镉的卵巢毒性及其可能的作用机制。 1.1氯化镉对卵泡发育影响 实验设氯化镉0.1~1.6μg/mL 5个浓度和溶剂对照,每组16~20个卵泡,三次重复。在培养d2暴露氯化镉后卵泡在体外连续培养11d,隔天换1/2液,收集隔天更换的培养液d4、8、11检测E_2激素,d11、12检测P。观察卵泡发育的形态学变化、测定d11卵泡存活率、有腔形成率和异常卵泡形成率,诱导排卵后测定COCs排出率。结果显示:形态学上可以观察到1.6μg/ml氯化镉出现较为明显细胞毒性,细胞呈圆形不能贴壁,突出培养板底部,基底膜模糊、缺损或消失,颗粒细胞松散或游离到卵泡外,卵泡轮廓不规则卵泡内出现黑色坏死区,卵母细胞逸出卵泡、变形、萎缩或崩解退化表现。暴露0.8-1.6μg/ml氯化镉对卵泡分泌E_2含量无明显影响,但可以明显降低P的分泌量,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明氯化镉可以抑制卵泡合成孕激素P。暴露1.2μg/mL以上氯化镉后d11卵泡存活率(66.44±3.95%)出现下降,与对照组(91.57±1.32%)比较差异有统计学意义(P<0.05),剂量与卵泡存活率之间存在一定的相关性,相关系数R~2为0.90;异常卵泡出现率(33.57±3.95%)明显升高,与对照组(8.44±1.32%)比较差异有统计学意义(P<0.05);暴露1.6μg/mL氯化镉后d11有腔卵泡形成率(42.51±6.66%)明显减少,与对照组(79.68±6.62%)比较差异有统计学意义(P<0.05);COCs排出率下降(24.99±3.95%),与对照组(52.78±8.45%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。 1.2氯化镉对不同发育阶段卵泡的影响 本实验根据大鼠卵泡体外发育形态学变化,以卵泡不同阶段发育阶段d2(腔前卵泡阶段)、d6(有腔卵泡阶段)、d11(排卵前卵泡阶段)为暴露时间点,研究氯化镉影响卵泡发育和卵母细胞成熟的敏感阶段;根据第一部分实验选择氯化镉0.8、1.2和1.6μg/ml三个浓度组和溶剂对照组,暴露氯化镉后卵泡在体外继续培养到d11,隔天换1/2液,每组16~20个卵泡,三次重复。结果显示:d2暴露1.6ug/mL氯化镉,培养到d11有腔卵泡形成率(42.51±6.66%)、存活率(52.51±7.84%)比d6有腔卵泡形成率(74.24±6.98%)、存活率(81.75±8.13%)减少,而异常卵泡率(47.49±7.48%)比day6异常卵泡率(18.23±8.17%)增加,差异有统计学意义(P<0.05);卵母细胞发育停止在GV阶段(58.34±11.79%),明显比d6(15.66±9.28%)、d11(20.2±2.86%)时间点数量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。 d6暴露氯化镉对卵泡发育、排卵和卵母细胞发育成熟无明显影响;虽然在相同浓度下,三个时间点暴露氯化镉对PB影响无明显差异,但d11暴露0.8-1.6μg/ml氯化镉对PB形成率的影响有一定剂量反应趋势,而IVM组1.6μg/mL氯化镉使PB减少(34.11±0.34%),与对照组(67.98±6.57%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。 以上结果说明卵泡不同发育阶段暴露一定剂量氯化镉对卵泡发育和卵母细胞成熟有一定影响:腔前卵泡阶段暴露氯化镉可以影响卵泡发育和卵母细胞的发育成熟(处于GV期),有腔卵泡阶段暴露氯化镉对卵泡发育和卵母细胞成熟无明显的影响,排卵前卵泡阶段暴露氯化镉可以影响卵泡排卵和卵母细胞PB形成。 2.邻苯二甲酸二(2一乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸单(2一乙基己基)酯(MEHP) DEHP和MEHP属于邻苯二甲酸酯类。动物实验发现DEHP的雌性生殖毒性作用主要是通过其代谢产物MEHP影响卵巢功能,作用位点主要是卵巢颗粒细胞。MEHP可显著抑制排卵前期颗粒细胞产生雌二醇,MEHP与大鼠颗粒细胞共同培养24小时后在降低孕酮分泌量的同时,也可以降低FSH诱导的cAMP蓄积量40%,孕酮分泌量的下降与MEHP存在剂量一效应关系。 本研究中MEHP设2.5~80μg/mL 6个浓度,DEHP设33.7~1000nM 6个浓度,同时设DMSO溶剂对照和阴性对照。每组16~20个卵泡,三次重复。在培养d2分别暴露化学物后卵泡在体外连续培养11天,隔天换1/2液,测定d11天卵泡存活率、有腔形成率、异常卵泡形成率和COCs排出率。结果显示DEHP对d11天卵泡存活率、有腔形成率、异常卵泡形成率和COCs排出率无明显的影响,与溶剂对照无显著性差异(P>0.05)。对照组和DMSO组也无统计学差异。d2暴露>10μg/mL以上剂量的MEHP 48h后,d11卵泡存活率明显下降(54.76±3.37%),与对照组(91.57+1.32%)比较差异有统计学意义(P<0.05),剂量与卵泡存活率之间存在一定相关性,相关系数R~2为0.92;COCs排出(24.99±3.95%)明显减少,与对照组(52.78±8.45%)比较差异有统计学意义(P<0.05);异常卵泡出现率(45.24±3.37%)明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);暴露>20μg/mL MEHP有腔形成率(46.18±1.67%)减少,与对照组(85.91±5.03%)比较差异有统计学意义(P<0.05),且有明显剂量反应关系。 本研究结果还说明大鼠卵泡体外培养方法不具有代谢活化能力,对需经代谢的间接生殖毒物可能需要加体外代谢活化系统,有待进一步研究。 3.噻氨酯哒唑(Nocodazole) 噻氨酯哒唑是一种干扰微管组装合成的抗肿瘤药物。和秋水仙素在β-tubulin上Arg-390竞争结合同一结合位点,直接影响微管聚合作用和微管依赖性进程。可以导致细胞周期永久性或短暂阻滞,以往研究证实噻氨酯哒唑可以明显地增加抑制在第一次减数分裂的卵泡数。本研究在卵泡培养d11加含终浓度为10、20、40nM噻氨酯哒唑暴露20h后观察卵泡排卵和卵母细胞成熟情况。结果显示:ⅣM组,COCs暴露100nM噻氨酯哒唑20h后出现卵母细胞细胞毒性,>5nM出现PB排出(23.19±14.35%)明显下降,与对照(67.96±6.57%)组比较差异有显著意义(P<0.05):腔前卵泡培养d11天暴露40nM噻氨酯哒唑后卵泡排出COCs数减少,与对照组比较差异无统计学意义,但存在剂量反应关系,说明噻氨酯哒唑可抑制卵泡排出COCs;同时,噻氨酯哒唑可以抑制减数分裂恢复,PB排出减少(19.35%),与对照组(37.78%)比较差异有统计学意义。 本研究用大鼠卵泡体外培养方法进一步揭示了四种卵巢毒物对卵泡发育、激素形成和卵母细胞成熟的影响,以及对不同发育阶段卵泡的毒作用特征,初步验证了大鼠腔前卵泡体外培养方法用于雌性生殖毒物鉴定和机制研究的可行性。 1、基本建立了小鼠腔前卵泡体外培养方法。 2、建立了大鼠腔前卵泡体外培养方法,国内外文献尚未报道比较完整地观察大鼠卵泡发育过程和卵子形成的体外培养系统。 3、用大鼠腔前卵泡培养方法观察了四种化学物对卵泡发育、激素合成和卵子形成的影响,以及对不同发育阶段卵泡的毒作用。进一步揭示了氯化镉、DEHP、MEHP、噻氨酯哒唑四种卵巢毒物的雌性生殖毒作用特征,为阐明其毒作用机制提供了某些依据。 4、初步提出一个以卵泡形态学改变、卵泡分化阶段、卵泡存活率、卵丘细胞粘液化、激素(E2、P)分泌量、卵母细胞直径、极体形成率为评价指标的大鼠腔前卵泡体外毒性研究系统。该系统可有效鉴定卵巢毒物,并可用于毒物作用阶段、作用特征等机制的研究,具有良好的潜在应用前景。由于该试验系统周期短、所用实验动物少、简便、受试物用量少,待进一步完善试验条件、优化评价指标和不同类型雌性生殖毒物验证后有望成为一种雌性生殖毒性的体外试验系统或替代方法。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R114

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 赵海波;何亚绒;李爱莉;任菊霞;;卵泡液干细胞因子水平对卵母细胞发育、受精和卵裂影响的实验研究[J];中国计划生育学杂志;2006年08期
2 夏品苍;张文昌;汪家梨;黄雅卿;陈丽萍;;镉的雌性性腺毒性与子宫、卵巢雌激素受体表达[J];海峡预防医学杂志;2005年06期
3 孙丽翠,刘朋朋,杨国庆,仲飞,戴钟铨,齐顺章;小鼠和兔原代乳腺上皮细胞的培养[J];生物技术;2004年02期
4 汪玉宝,高敏芝,顾敦瑜,吴晓云,陈淑颖,陆湘,何志英;小鼠窦前卵泡的体外培养[J];复旦学报(医学版);2004年01期
5 李煌元 ,吴思英;镉的雌性性腺生殖毒性研究现状[J];中国公共卫生;2002年03期
6 刁书永,袁慧;镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响研究[J];畜牧兽医学报;2005年11期
7 吴思英;镉的生殖毒性流行病学研究进展[J];现代预防医学;2002年03期
8 张天宝;大鼠卵巢细胞体外培养及生殖毒理研究中的应用[J];卫生毒理学杂志;1997年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘慧杰,舒为群;邻苯二甲酸酯类化合物的毒理学效应及对人群健康的危害[J];第三军医大学学报;2004年19期
2 陶志云;陶勇;章孝荣;;哺乳动物性反转分子机制的研究进展[J];动物医学进展;2005年12期
3 赵丹凤;刘丽均;徐平;张守纯;赵立虎;谢夏阳;;影响胞质内单精注射受精率的相关因素[J];中国畜牧兽医;2007年01期
4 秦俊法,李增禧;镉的人体健康效应[J];广东微量元素科学;2004年06期
5 顾祖维;吴世达;刘美霞;陈良;;关于我国化学物的职业卫生标准制定的若干意见[J];工业卫生与职业病;2006年05期
6 王官仁;李东风;李乐德;;唯支持细胞综合征研究进展[J];医学临床研究;2006年10期
7 仲伟鉴,应贤平;毒物基因组学展望[J];环境与职业医学;2004年05期
8 顾祖维;我国毒理学的回顾与展望[J];上海预防医学杂志;2004年06期
9 朱善良;陈龙;;镉毒性损伤及其机制的研究进展[J];生物学教学;2006年08期
10 韩伟;章孝荣;;哺乳动物体细胞核移植中供体细胞的研究进展[J];生物技术通讯;2006年05期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 陈媛;杨菁;;卵泡体外成熟培养研究进展[A];湖北省性学会第二届第二次学术年会论文集[C];2005年
2 孟帆;王兰;陈学英;王茜;张婷;郝冬亮;;镉对河南华溪蟹卵巢形态的影响[A];中国动物学会北方七省市动物学会学术研讨会论文集[C];2005年
3 庄惠生;罗争峰;王琼娥;;镉致植物污染损伤的发光性质研究[A];第六届全国光生物学学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 唐将;三峡库区镉等重金属元素迁移富集及转化规律[D];成都理工大学;2005年
2 廖艳;异烟肼与利福平肝毒性的代谢组学研究[D];四川大学;2005年
3 谌宏伟;污染场地健康风险评价[D];中国地质大学(北京);2006年
4 徐境羚;马鹿精子膜蛋白纯化与理化性质分析[D];东北林业大学;2007年
5 高飞;前列腺素转运蛋白及代谢酶在小鼠早期妊娠子宫中的表达与调节[D];东北农业大学;2007年
6 白英;微量元素锌(Zn)对山羊β-酪蛋白合成及分泌影响的研究[D];内蒙古农业大学;2007年
7 文卫华;职业砷接触人群健康危害与遗传毒性研究[D];四川大学;2007年
8 杜娟;奶牛乳腺上皮细胞高温应答机制的研究[D];南京农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋舜尧;六氯苯和镉(Ⅱ)作用下鱼肝线粒体酶和蛋白质差异表达研究[D];武汉大学;2005年
2 蔡翔;氟吗啉对斑马鱼繁殖的环境雌激素效应的初步研究[D];新疆农业大学;2005年
3 李擒龙;纺锤体组装关卡基因hsMAD2在HCC中的表达及其对HepG2作用的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
4 王茜;镉、铜对长江华溪蟹(SINOPOTAMON YANGTSEKIENSE)在细胞和分子水平的影响[D];山西大学;2003年
5 李煌元;镉的雌性性腺毒性与雌激素受体关系的实验研究[D];福建医科大学;2003年
6 罗争峰;镉、铅环境生物标志物的研究[D];东华大学;2004年
7 赵宇侠;自然水体生物膜有机组分对铅、镉吸附特征研究[D];吉林大学;2004年
8 张菁菁;采集的生物膜主要化学组分萃取分离及其对铅、镉的吸附热力学特征研究[D];吉林大学;2004年
9 傅鹏;H98遗传毒性及生殖毒性实验研究[D];天津医科大学;2004年
10 崔新仪;氟吗啉对大鼠内分泌干扰效应的初步研究[D];新疆农业大学;2004年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 张天宝;大鼠卵巢细胞体外培养及生殖毒理研究中的应用[J];卫生毒理学杂志;1997年02期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 林雪玲,卢玉葵;小鼠卵巢颗粒细胞条件培养液中蛋白质和激素水平[J];佛山科学技术学院学报(自然科学版);2000年03期
2 申立军,周袁芬,金泰廙;镉雌激素样作用的实验研究[J];劳动医学;2001年02期
3 郑鸿培,曾长军,张安居,侯容,张志和,张美佳,兰景超,王基山,何萍,张瑛;小鼠腔前卵泡的分离采集和体外成熟研究[J];四川农业大学学报;2001年03期
4 阙华发,高尚璞,陈红风,贾喜花,徐杰男,陆德铭,唐汉钧;乳宁Ⅱ号对乳腺癌MA-891细胞株生长转移的影响[J];上海中医药大学学报;2001年04期
5 张琦,王晓宁,高而威,程治平;大鼠黄体细胞酪氨酸含量及hCG,cAMP和孕酮对含量的影响[J];生理学报;1989年01期
6 下训诚,秦涌,李建新,项翠琴;镉对雌性大鼠排卵功能的影响[J];卫生毒理学杂志;1992年01期
7 张文昌,吴志仁,李煌元,阎平,吴思英,蔡猛森;染镉雌性大鼠垂体、卵巢对性腺激素的反应机能状况[J];卫生毒理学杂志;2002年01期
8 张振龙,倪道明;动物乳腺生物反应器的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2000年04期
9 张文昌!350004.福州,李煌元!350004.福州,江一平,王章敬!350004.福州,林炜!350004.福州,罗方洪,李典粱;镉对大鼠雌性性腺毒性研究[J];中国职业医学;1999年05期
10 胡润淮,裴广战;RP-HPLC法测定复方仙灵脾注射液中淫羊藿苷含量[J];中成药;2002年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 万旭英;张天宝;;卵巢卵泡体外培养系统及其在生殖毒理学中的研究进展[J];毒理学杂志;2009年06期
2 施旭东,孙贝加,王衡,王公金,糜祖煌,王金锋,汪河海,曹步凯,范必勤,陈杰;小鼠腔前卵泡体外发育研究[J];中国优生与遗传杂志;2001年03期
3 戚中田;;丙型肝炎病毒的细胞培养系统[J];微生物与感染;2007年02期
4 施旭东,孙贝加,陈华,王金锋,糜祖煌,王衡,谭笑梅,王公金,范必勤,陈杰;人腔前卵泡体外培养研究[J];中国优生与遗传杂志;2001年02期
5 徐大刚;黄蕙芬;;影响丝虫感染期幼虫体外培养的各种因素[J];遵义医学院学报;1986年04期
6 张杰;孙兴参;毛冠平;周佳勃;;内分泌和旁分泌因子在腔前卵泡体外培养中的作用[J];解剖学杂志;2007年03期
7 徐大刚;;丝虫感染期幼虫体外培养的进展[J];遵义医学院学报;1986年01期
8 方艳秋,谭岩,段秀梅,张雪松,刘立华,时阳;IL-18在体外培养系统中诱导肿瘤快速杀伤效应及肿瘤特异性CTL[J];免疫学杂志;2004年04期
9 刘娟娟;殷国荣;;弓形虫包囊体外培养的研究进展[J];国外医学.寄生虫病分册;2005年06期
10 代杰文;胡冰;王昊;王松灵;;小鼠颌下腺器官体外培养研究[J];北京口腔医学;2009年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 万旭英;朱玉平;朱江波;马玺里;刘珍;王飞;许桂风;侯娟;张天宝;;大鼠腔前卵泡体外培养系统的建立(摘要)[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年
2 常迪;崔旭;高雅;梁鸿斌;倪和民;;不同分离方法及培养方式对绵羊腔前卵泡发育能力的影响[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
3 潘红平;石德顺;冯贵雪;;动物腔前卵泡的研究新进展[A];第三届广西青年学术年会论文集(自然科学篇)[C];2004年
4 谭岩;;体外培养系统中IL-18诱导的快速肿瘤杀伤效应影响因素的研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
5 郑瑞珍;辛俭;高晓虹;宋红立;王育哲;;家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
6 方艳秋;;IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
7 万旭英;朱玉平;朱江波;马玺里;侯娟;刘珍;王飞;许桂风;张天宝;;小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立(摘要)[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年
8 梁洋;孙兴参;刘娣;安铁洙;;FSH对腔前卵泡生长发育的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2006年
9 吴志明;闫若潜;刘光辉;赵雪丽;张志凌;张健;;猪附红细胞体的体外培养研究[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
10 禹学礼;栗颖华;邓雯;孟雨;;牛腔前卵泡卵母细胞体外受精研究[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 曲日胜 张启军;肿瘤过继免疫疗法进入临床[N];健康报;2006年
2 原驰 晓彦;吉林大学恶性肿瘤临床研究达国际先进水平[N];吉林日报;2006年
3 记者 王艳红;显微受精试管马被育出[N];新华每日电讯;2001年
4 记者 郭晓斌;岱鹰“丙肝全病毒及体外细胞培养”获中国专利金奖[N];陕西日报;2004年
5 林黎民;丙肝病毒体外培养获成功[N];中国医药报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 万旭英;大、小鼠卵泡培养方法及其在雌性生殖毒性研究中的应用[D];第二军医大学;2008年
2 潘红平;动物腔前卵泡分离培养的研究[D];广西大学;2004年
3 李晓云;家畜附红细胞体体外无细胞培养研究[D];华中农业大学;2008年
4 罗珊;TGF-β1对小鼠体外胚胎发育和胚胎种植的影响及其作用机制的研究[D];四川大学;2007年
5 姚桂东;MiRNA-224参与小鼠卵泡发育调控作用的研究[D];中国科学技术大学;2011年
6 冯贵雪;卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究[D];广西大学;2006年
7 尹宝英;Cx37和Cx43在小鼠卵泡中的表达研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 白莉雅;生长因子及表观修饰对牛卵泡发育的调控及其机制研究[D];华中农业大学;2011年
9 何宝祥;水牛卵泡颗粒细胞凋亡和几种抗氧化剂对体外卵泡颗粒细胞存活的影响[D];甘肃农业大学;2003年
10 陶勇;一氧化氮与猪卵母细胞减数分裂成熟[D];中国农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张耀君;小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究[D];陕西师范大学;2010年
2 马莉;冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究[D];郑州大学;2011年
3 夏仪;大鼠腔前卵泡体外三维培养系统的建立及其在雌性生殖毒性研究中的应用[D];第二军医大学;2012年
4 张彦朋;小鼠腔前卵泡体外培养的研究[D];西北农林科技大学;2011年
5 宋文强;小鼠死亡后腔前卵泡体外成熟培养研究[D];中南民族大学;2011年
6 王毅;小鼠腔前卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较[D];华中科技大学;2012年
7 高志花;牛腔前卵泡体外无血清培养及超微结构研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年
8 曾长军;家猫腔前卵泡的分离采集和体外成熟研究[D];四川农业大学;2001年
9 冯贵雪;水牛腔前卵泡分离培养的初步研究[D];广西大学;2003年
10 彭勇;牛腔前卵泡体外培养研究[D];四川农业大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026