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《第二军医大学》 2009年
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三种西沙海绵化学成分和生物活性研究

张红军  
【摘要】: 我国南海海洋生物中含有许多结构新颖且具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗过敏和免疫调节等不同生物活性的次生代谢产物,它们是寻找高效低毒药物或先导化合物的新来源。本文作者对我国南海西沙海域的海洋生物资源进行了考察,对采集到的31种海绵样本的93个提取部位进行了体外活性筛选,发现有11种海绵的提取物具有显著的体外抗肿瘤活性。通过多种现代色谱分离纯化技术,从其中的3种海绵Phyllospongia foliascens、Phakellia fusca和Theonella swinhoei中共分离得到了66个单体化合物;采用多种波谱方法鉴定了其中63个化合物的结构,包括:17个甾体类化合物、12个萜类化合物、11个环肽类化合物、17个生物碱类化合物、5个嘧啶类化合物和1个苯甲酸,其中新化合物12个。在体外药理活性筛选中,部分二倍半萜、环肽和甾体类化合物显示出细胞毒活性。 采自永兴岛和石岛的杯叶海绵P. foliascens的丙酮提取物显示对小鼠肝癌腹水瘤HAC细胞和小鼠结肠癌Colo-26细胞的IC50值均小于1μg/mL。运用溶剂分步萃取以及减压柱色谱、低压柱色谱、中压柱色谱、凝胶柱色谱和高效液相制备等多种色谱分离方法,从其石油醚和二氯甲烷萃取部位分离鉴定了共22个化合物A1~A22,包括11个甾体类化合物和11个二倍半萜类化合物。运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC (HSQC)、HMBC、NOESY (ROESY)和MS等波谱技术,结合文献,确定了它们的结构分别为:β-sitosterol (A1), cholesta-5,7-dien-3β-ol (A2), ergosta-5,7,24(28)-trien-3β-ol (A3), ergosta-5,7-dien- 3β-ol (A4), (24E)-stigmasta-5,7,24(28)-trien-3β-ol (A5), stigmasta-5,7-dien-3β-ol (A6), ergosterol (A7), phylloketal (A8), phyllohemiketal A (A9), phyllofenone A (A10), phyllofolactone B (A11), 20,24α-dimethyl-scalaran-12α-ol-25,24-lactone (A12, phyllofolactone M), 24-oxo-24-homoscalar-16,25(26)-dien-12α-ol (A13, phyllofenone D), phyllofenone B (A14), 20,24-dimethyl-24-oxo-25-norscalar-16- en-12α,18β-diol (A15, phyllofenone E), 24β-methyl-12-oxoscalaran-16β-ol-25,24- lactone (A16, phyllofolactone L), phyllofolactone A (A17), phyllofolactone C (A18), (24E)-5α,6α-epoxystigmasta-7,24(28)-dien-3β-ol (A19), 5α,6α-epoxystigmasta-7,22-dien-3β-ol (A20), 5α,6α-epoxycholest-7,22-dien-3β-ol (A21), 5α,6α-epoxycholest-7- en-3β-ol (A22);其中,4个二倍半萜类化合物A12、A13、A15、A16和1个甾体类化合物A19为新化合物;10个甾体类化合物A1~A7, A20~A22为首次从该属海绵中分离得到的化合物。化合物A11和A12是通过HPLC分离获得的CH3-26立体异构的phyllofolactones类二倍半萜,它们的构型是通过碳谱的化学位移确定的。化合物A13和A14是目前仅从我国南海海绵中获得的2个环E为含α,β-不饱酮的五元碳环结构的phyllofolactones类二倍半萜成分。体外抗肿瘤活性筛选中,化合物A10, A13, A14, A15, A16, A17对小鼠白血病P388细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为15.3, 6.5, 11.9, 30.2, 25.6, 10.5μg/mL;化合物A13, A14对人肝癌BEL-7402细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为47.8, 32.9μg/mL;化合物A10, A15对人肺癌SPC-A-1细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为23.6, 29.3μg/mL;化合物A11, A12, A15对小鼠肝癌腹水瘤HAC细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为46.7, 32.5, 45.1μg/mL;化合物A10, A13, A14, A15对小鼠结肠癌Colo-26细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为23.5, 11.9, 28.1, 26.9, 42.7μg/mL。采自永兴岛和七连屿附近的棕色扁海绵P. fusca的乙醇提取物对小鼠结肠癌Colo-26细胞的IC50值小于1μg/mL,对小鼠肝癌腹水瘤HAC细胞的IC50值为6.4μg/mL。运用溶剂分步萃取以及多种色谱分离方法,从其二氯甲烷和正丁醇萃取部位分离鉴定了共27个化合物B1~B27,包括10个环肽类化合物和17个生物碱类化合物。运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY (MQF-COSY)、HMQC (HSQC)、HMBC、TOCSY、HMQC-TOCSY、NOESY (ROESY)、MS和X-Ray等波谱技术,结合文献,确定它们的结构分别为:cyclo(-Pro1-Phe-Gly-Pro2-Thr- Leu-Trp-) (phakellistatin 13, B1), cyclo(-Pro1-Trp-Val-Pro2-Leu1-Thr-Pro3-Leu2-) (hymenamide H, B2), cyclo(-Pro1-Pro2-Tyr-Val-Pro3-Leu-Ile1-Ile2-) (hymenistatin 1, B3), cyclo(-Pro1-Pro2-Tyr-Val-Pro3-Leu1-Ile-Leu2-) (hymenamide G, B4), cyclo(-Pro1- Trp-Val-Pro2-Leu-Ile1-Pro3-Ile2-) (B5), cyclo(-Pro1-Trp-Ile-Pro2-Leu1-Thr-Pro3-Leu2-) (B6), cyclo(-Pro1-Tyr-Pro2-Ile1-Phe-Pro3-Ile2-) (B7), cyclo(-Pro1-Phe-Gly-Pro2- OMe-Glu-Leu-Trp-) (B8), cyclo(-Pro-Tyr1-Asp-Phe-Trp-Lys-Val-Tyr2-) (hymenamide J, B9), cyclo(-Pro-Phe-Asp-Ser-Lys-Ala-Val-Thr-Tyr-) (B10), aldisin (B11), 2-bromoaldisin (B12), 5-bromopyrrole-2-carboxamide (B13), 4,5-dibromopyrrole- 2-carboxamide (B14), 5-bromopyrrole-2-carboxylic acid (B15), dibromophakellin(B16), dibromoisophakellin (B17), monobromophakellin (B18), (Z)-debromohymenialdisine (B19), (Z)-hymenialdisine (B20), (Z)-debromoaxionhdantion (B21), (Z)-axionhdantion (B22), manzacidin C (B23), manzacidin A (B24), manzacidin B (B25), N-methylmanzacidin C (B26), taurodispacamide A (B27)。所有环肽化合物B1~B10都通过MALDI TOF/TOF从头测序方法获得了氨基酸残基连接信息,确证了NMR的结构鉴定。其中,5个环肽类化合物B5, B6, B7, B8, B10为新化合物;化合物B2~B4, B9, B23~B27为首次从该种海绵中获得。化合物B9和B10为首次从Phakellia属海绵正丁醇萃取部位获得的水溶性环肽。化合物B1的绝对构型通过CuKαX-Ray单晶衍射实验得到了确认。化合物B10在DMSO-d6中显示具有两个构象存在,通过脯氨酸残基碳化学位移Δδβγ值和NOESY相关信号证实在其主要构象和次要构象中脯酰胺肽键分别为反式和顺式构型。体外抗肿瘤活性筛选中,化合物B3, B6, B10对小鼠白血病P388细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为8.3, 7.8, 5.6μg/mL;化合物B1, B6, B10对人肝癌BEL-7402细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为12.7, 30.4, 14.8μg/mL;化合物B1对人肺癌SPC-A-1细胞显示有细胞毒活性,IC50值为11.6μg/mL;化合物B1, B3, B9, B10对小鼠结肠癌Colo-26细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为23.5, 11.9, 28.1, 26.9, 42.7μg/mL。本文所获得的环肽和生物碱类成分的其它的生物活性值得进一步研究。 采自永兴岛和七连屿附近的隋氏蒂壳海绵T. swinhoei的乙醇提取物对小鼠肝癌腹水瘤HAC细胞的IC50值小于3μg/mL,对小鼠结肠癌Colo-26细胞的IC50值小于1μg/mL。运用溶剂分步萃取以及减压柱色谱、低压柱色谱、中压柱色谱、凝胶柱色谱和高效液相制备等多种色谱分离方法,从其二氯甲烷和正丁醇萃取部位分离鉴定了共14个化合物C1~C14,包括1个三萜类化合物、6个甾体类化合物、1个环肽类化合物、5个嘧啶类化合物以及1个苯甲酸。运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC (HSQC)、HMBC、NOESY (ROESY)和MS等波谱技术,结合文献,确定它们的结构分别为: 32,35-anhydrobacteriohopanetetrol (C1), 7α-hydroxylconicasterol (C2), conicasterol (C3), theonellasterol (C4), 7α,14α-dihydroxylconicasterol (C5), 9α-hydroxyl-15- oxoconicasterol (C6), 3β,8β-dihydroxyl-4-methylene-B-norergosta-6-aldyhyde (C7), orbiculamide A (C8), thymine (C9), thymidine (C10), uracil (C11), thymidine-5′-carboxylic acid methylester (C12), thymidine-5′-carboxylic acid butyl ester (C13), benzoic acid (C14)。其中,化合物C6和C7为首次发现具有7-OH或8-OH以及降B环结构的4-methylene甾体类新化合物;化合物C1, C12, C13, C14为首次从该种海绵中获得。体外抗肿瘤活性筛选中,化合物C7, C8对小鼠白血病P388细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为40.3, 0.65μg/mL;化合物C8对人肝癌BEL-7402细胞显示有细胞毒活性,IC50值为1.7μg/mL;化合物C6, C7, C8对人肺癌SPC-A-1细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为27.9, 33.1, 19.3μg/mL;化合物C5, C8对小鼠结肠癌Colo-26细胞显示有细胞毒活性,IC50值分别为24.7, 2.3μg/mL。 本课题采用活性筛选追踪的方法,运用多种现代色谱分离技术,对采自中国西沙海域的海绵提取物的体外活性和化学成分进行了研究并有新的活性成分的发现。特别是对天然产物中数量相对较少的二倍半萜和环肽类化学成分进行了系统的分离、结构测定和活性研究,为寻找海洋生物活性成分积累了新的研究资料。从杯叶海绵P. foliascens中得到的二倍半萜成分、从棕色扁海绵P. fusca中得到的生物碱和环肽类成分以及从隋氏蒂壳海绵T. swinhoei中获得的甾体和环肽类化合物在结构上既具有各自生物种属的化学特征,同时也体现出西沙海绵的独特性。研究结果同时也揭示了我国南海海洋生物具有的生物和化学多样性,显示出了南海海洋生物资源具有的研究潜力,为进一步开发和利用我国丰富的海洋生物资料提供了科学依据。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R284

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