地黄内生真菌及其活性代谢产物的研究

【摘要】： 微生物一直是人们获得活性物质的丰富资源,多种具有良好治疗效果的抗生素都是从微生物中得到。在过去的70多年里,已从微生物中发现了30000-50000中天然产物,8000多种是抗菌抗肿瘤剂。内生真菌逐渐成为研究的热点,为新型抗生素的筛选提供了大量先导化合物。 植物内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部,而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物,在长期进化过程中与寄主协同进化,在演化过程中两者形成了互惠共生关系。 这些次生代谢产物多数具有一定的生物活性,有在医药领域应用的潜力。 本课题组于2007年3月,从河南温县采集地黄植物根部材料样本,24小时内运至上海,随即对其内生真菌进行分离。获得623个菌株,初步形态观察对照后去除重复菌株,得到菌株36个。所得菌株小样培养后制备提取液,高效液相检测菌丝及培养液提取物制作指纹图谱。得到的指纹图谱进一步核实比对,最终确定无重复菌株数目为22株,实验证明菌株分离过程中采用多种分离培养基有助于分到更多不同种类的内生真菌。所得的菌株统计结果显示有四株真菌相对稳定的存在于该植物组织中(分离频率1%),其余菌株分离频率小于1%;此四株菌株分别被鉴定为Rhizoctonia sp.,Chaetomium sp.,Verticillium sp.,Mucor sp.。分离统计数据显示部分内生真菌较稳定的存在于该植物中,而另一些则仅仅偶然寄生于该植物。通过稻瘟霉模型筛选具有抗性代谢产物的真菌菌株,检测结果显示其中三株菌(Chaetomium sp., Verticillium sp.,Xylaria sp.)的提取物对稻瘟霉显示明显的抗性,抗真菌采用了白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)四种菌株,活性较好有不同程度的抑制作用,其中两种具有良好活性。 通过以上研究,得出一些有意义的结果,主要包括:(1)从植物地黄中分离得22株无重复内生真菌,表明地黄内生真菌的生物多样性同时说明某些菌株较稳定的生活在此植物中;(2)在分离试验中发现培养基对于内生真菌的分离有一定影响,采用多种培养基能分离到更全面具有多种适应性的菌株;(3)通过两种相互拮抗试验模型说明内生真菌之间的生存竞争会显著抑制彼此菌丝的生长;(4)通过柱层析对这3株内生真菌的发酵产物进行分离纯化,得到单体化合物12种,最终彻底阐明其中9种化合物,均与地黄中已报道的成分无关。综上所述,本实验为开发应用内生真菌及其活性产物提供了一定的理论和化学依据。 将三株有抗性产物的菌株大量培养,乙酸乙酯成功提取其活性产物。积累此三株菌的提取物,经硅胶,葡聚糖凝胶分离后共获得12个化合物,确证其中9种化合物的结构,其余三种化合物需进一步确认结构。三种为首次报道化合物, D762为苯并呋喃酮类物质,D769为一种具有四五螺内酯结构的新颖化合物。