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《第二军医大学》 2009年
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甲基汞中毒神经系统损伤的病理演变及与Rho/Rock信号通路的关系

吕伟  
【摘要】: 研究目的:研究氯化甲基汞(MMC)中毒大鼠神经系统的病理变化及机制,并观察Rho/Rock信号系统的激活是否参与了汞中毒神经系统的损伤。 研究方法:采用雄性Wistar大鼠30只,体重300-350g,随机分为正常对照组6只,实验组共分为4组,每组6只,氯化甲基汞按4.0mg/kg体重/日连续灌胃建立汞中毒动物模型,分别在7、11、15、19天后处死并进行了下列处理:1、采用组织及免疫病理手段在不同的时间点动态观察了小脑、脊髓、后根神经节及坐骨神经的病理演变;2、采用Westernblot技术及免疫组织化学技术观察了汞中毒早期Rho/Rock信号系统的表达,探讨Rho/Rho激酶信号系统与胶质细胞反应在汞中毒神经系统损伤中的意义。同时动态观察大鼠体重变化及卒中指数评分、神经病学症状评分的变化。 结果:1、动物行为学改变汞中毒后大鼠首先表现出运动能力的减弱,并逐渐运动减少,肢体瘫痪,共济失调,或爬行和转圈,体重减轻,卒中指数评分和神经病学损伤指数比对照组显著增加,并随中毒过程而逐渐加重,对照组无此类表现。2、组织病理改变:(1)周围神经:服用氯化甲基汞后第7天,各种染色手段均未观察到有轴索变性和髓鞘脱失。染毒后第11天,在坐骨神经的远端,半薄切片甲苯胺兰染色及APP,NF-200免疫组化染色,可观察到有轻微的轴索变性,但连接神经节的近端部分神经未见明显变性,KB染色及MBP未观察到髓鞘脱失改变。第15天开始轴索变性加重,并波及近端及神经节内纤维,在轴索染色系列上包括Bodian、APP等均呈现为轴索断裂,同时MBP染色证实有髓鞘脱失,MRF-1染色显示有少量的吞噬细胞反应。第19天APP、Bodian、NF200/68免疫组化染色均显示在周围神经远近端轴索变性明显,表现为轴索断裂,呈块状深染,有大量髓磷脂小球的形成。髓鞘染色系列KB,MBP显示大量髓鞘破坏,后根神经节内髓鞘亦有明显脱失,HE染色可见有吞噬有髓磷脂的吞噬细胞。MRF-1染色示神经内中度吞噬细胞反应。(2)小脑的病理变化:大鼠服用MMC第11天,各种染色未见小脑组织病理异常。第15天,大鼠脑回深部近白质区的颗粒层,TUNEL染色显示阳性散在的凋亡细胞,但数量较少,提示细胞凋亡,凋亡细胞主要位于脑回的深部近白质区。HE染色未见颗粒层细胞破坏,MRF-1及GFAP免疫组化染色显示开始出现少量小胶质细胞反应和星形细胞增生,并与细胞凋亡的区域平行。第19天,HE染色上可见颗粒细胞的减少,有破碎的细胞,TUNEL染色显示有大量的凋亡细胞比第15天明显增加,MRF-1染色可见大量的吞噬细胞浸润,GFAP示大量的小胶质细胞反应及星形细胞增生。(3)脊髓:汞中毒7天时未见到明显的病理改变。第11天时可见到脊髓后索白质区出现轻微空泡变性,前索和侧索结构及形态正常,在脊髓胶状质下区可见到少量MRF-1染色阳性的小胶质细胞反应。第15天时脊髓后索变性明显,可见明显的空泡变性,后根出现的变性,表现为轴索断裂,髓鞘脱失,部分神经纤维呈块状染深,而前索和侧索均未出现明显的病理改变。19天时后索、后根的病理变化与15天时相似,但损害程度有所加重。3、Rho/ROCK信号通路表达:在中毒7天即可观察到小脑、脊髓、和周围神经中神经元和胶质细胞ROCK2表达升高,在吞噬细胞和轴突中ROCK2表达与中毒时间相关呈正相关。4、Rock2免疫组化染色及Westernblot分析:染毒后第7天,在小脑颗粒层细胞中可见到胞浆棕黄色深染的细胞,可能主要是颗粒细胞,但部分也可能为胶质细胞。第11天ROCK2阳性的细胞数量较第7天时为明显,随中毒时间的延长,ROCK2阳性的细胞数量增加,主要见于增生的星形胶质细胞和小胶质细胞,也可见于神经元,总体上ROCK2阳性的细胞数量的与MRF-1阳性细胞在分布及数量上均有平行关系,提示汞中毒后期的ROCK2的表达可能主要与胶质细胞反应有关。染毒后第7天,在三叉神经节及后根神经节中均可见到位于胞浆表达的棕黄色深染的神元经,提示存在ROCK2激活的神经元。第11天,ROCK2阳性的神经元的数量较前有所增加,除见于神经节细胞外,雪旺氏细胞的胞浆也表现为阳性着色。15第天及第19天,ROCK2阳性细胞的数量较前增加明显,表达细胞为雪旺氏细胞、吞噬细胞及部分神经节细胞。坐骨神经的ROCK2免疫组化染色与神经节呈现相同的变化规律,表达部位主要见于雪旺氏细胞的及吞噬细胞。Westernblot分析表明在汞中毒后第7天,Rock2在大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及三叉神经半月节内有明显的表达,较对照组有显著升高,提示Rho信号系统的激活。 结论:1、采用4.0/kg/day氯化甲基汞连续灌胃法可以成功建立大鼠亚急性汞中毒模型。 2、该中毒模型神经系统损害的靶器官为小脑、周围神经的感觉部分及脊髓的后索、后根。 3、汞中毒后存在Rho/Rock信号通路的激活,早期表达见于神经元及胶质细胞,而后期与胶质细胞反应呈平行关系,提示该信号通路的激活与汞中毒的神经系统的损伤有密切关系,其机制值得进一步研究。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R595.2;R747.9

【引证文献】
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>浙江大学
>第二军医大学
相关作者
>吕伟 >马岳峰
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