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含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒转染人肝癌细胞HepG2后的作用机制研究

陈永安  
【摘要】: 背景:肝癌是世界第五大癌症,全球每年50万~100万新发病例和近100万死亡病例,至今还未有特别有效的治疗方法,寻找更好的治疗方法成为肝癌治疗面临的重大问题,利用基因工程手段进行肝癌的基因治疗已成为目前人们普遍关注和研究的热点。 蜂毒素体外抗肿瘤作用明显,而且作用发生迅速,但因具有溶血的副作用而限制了临床应用。由于肝癌细胞及肝细胞对腺病毒十分敏感,对AFP阳性肝癌,将蜂毒素基因置于AFP调控元件之下,以腺病毒为载体转染可以使肝癌细胞被选择性杀伤,从而避免了蜂毒素的直接溶血作用。基于以上想法,我科以往的研究已经成功构建了含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒(Ad-rAFP-Mel)及不含蜂毒素基因的重组腺病毒(Ad-rAFP),体内外实验已证实Ad-rAFP-Mel对AFP阳性肝癌细胞确有非常明显的抑制或杀伤作用。我们的研究主要是在以往的工作基础上,明确Ad-rAFP-Mel转染HepG2细胞的作用模式,并探讨其相关分子机制,为进一步推向临床提供实验依据。 目的:1.体外观察含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒作用于肝癌细胞株HepG2后细胞的生长状况和形态学变化。 2.对含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒引起肝癌细胞死亡的相关机制进行探讨。 3.为临床应用有毒中药有效成份以基因重组载体转染的方式进行中药生物治疗HCC提供科学的实验依据。 方法:1.通过倒置显微镜下观察细胞生长情况、HE染色、Hoechst33258染色、透射电镜等手段观察含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒作用于肝癌细胞后细胞死亡情况、细胞器的结构变化等形态学变化。 2.采用AnnexinV/PI凋亡试剂盒通过FCM分析检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒诱导细胞凋亡的情况。 3.采用罗丹明123、PI双染色法,FCM检测线粒体膜电位。Fura-2染色,FCM检测细胞内Ca2+变化,探讨Ad-rAFP-Mel作用于肝癌细胞后对细胞生物膜的影响。 4.基于对细胞凋亡诱导的确定性判断,采用Western blot方法检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒作用后细胞凋亡相关蛋白caspase家族的改变情况,观察对细胞凋亡相关蛋白的影响。 结果:1.形态学观察结果显示随着病毒感染指数的增高和时间的延长,活细胞数量减少,HE染色显示坏死与凋亡并存,Hoechst33258染色显示确有凋亡存在,透射电镜证实rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒作用于肝癌细胞后是凋亡和坏死兼而有之。 2.含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒感染复数在MOI=25以上能够显著诱导HepG2细胞的凋亡,凋亡率随时间及感染复数的增加而逐渐增加,呈时间剂量依赖性(8 h、12 h、24 h、72 h)。 3.罗丹明123、PI双染色法, FCM检测细胞线粒体膜电位显示12 h开始,随着病毒感染指数的增高和时间的延长,线粒体膜电位逐渐降低,各Ad-rAFP-Mel转染组与空白对照组及Ad-rAFP转染组间比较差异有统计学意义(P0.05)。 4. Fura-2染色FCM检测细胞内Ca2+浓度显示8 h开始,随着病毒感染指数的增高和时间的延长,细胞内钙离子的荧光强度逐渐增强,各Ad-rAFP-Mel转染组与空白对照组及Ad-rAFP转染组间比较差异有统计学意义(P0.05)。 5.Western blot检测显示MOI=400浓度含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒作用8h细胞凋亡相关蛋白caspase9、3开始活化,24h内逐渐明显,72 h仍有活化, caspase12未见明显活化。 结论: 1.含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒能够抑制HepG2细胞的生长,细胞死亡呈现坏死与凋亡兼有的特征。 2.含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒能够使HepG2细胞线粒体膜电位下降,细胞内Ca2+浓度升高,其作用可能与影响细胞生物膜结构有关。 3.含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒能够上调细胞凋亡相关蛋白caspase家族水平,诱导HepG2细胞的凋亡;含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒诱导的细胞凋亡与细胞凋亡相关蛋白caspase家族信号通路的活化增加有关。


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