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《第二军医大学》 2010年
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氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能影响及机制研究

吴建祥  
【摘要】: 研究背景:高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)除了具有促进胆固醇逆转运、保护血管内皮、抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多方面有益作用外,还有研究发现,HDL可以通过改善内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)数量及功能,从而有助于血管损伤后的修复。然而,在许多情况下HDL水平升高却并不介导保护作用,相反会导致心血管事件发生增加,造成这种现象的原因可能在于升高的HDL并不具备心血管保护作用,此时“高水平HDL”反而促进心血管事件的发生。目前已知,在糖尿病、冠心病等条件下,HDL易氧化修饰生成氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)而发生功能逆转成为致病因素,但ox-HDL对EPCs功能的作用以及机制如何并不清楚。 研究目的:本研究旨在在前期有关EPCs研究的基础上,进一步观察ox-HDL对EPCs功能的影响并探讨其中的作用机制,为针对HDL功能改善的治疗以及减少EPCs功能损害奠定基础。 研究方法:首先采用密度梯度离心法从人外周血中分离、培养、鉴定得到EPCs。接下来,我们从三个方面研究ox-HDL对EPCs功能的影响及机制:(1)ox-HDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选:采用人基因表达芯片检测ox-HDL干预后EPCs基因表达的变化,并通过realtime PCR和Western Blot方法进一步验证差异基因;(2)ox-HDL对EPCs功能的影响:在第一部分研究结果的基础上,将EPCs分为对照组、HDL干预组(50ug/ml)、不同浓度ox-HDL干预组(10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml)、CD36中和抗体阻断组和CD36中和抗体阻断加ox-HDL干预组,其中CD36中和抗体于干预前2小时提前加入,然后采用MTT法检测细胞增殖情况、ANNEXIN V/PI法检测细胞凋亡水平、ROS荧光法检测细胞内氧化应激水平、Transwell小室迁移实验检测EPCs迁移能力、Matrigel方法检测体外血管形成能力,ELISA方法检测细胞培养上清中的细胞因子(VEGF和TSP-1),此外,通过结扎离断右侧股动脉建立裸鼠单侧下肢缺血模型,模型建立后通过尾静脉输注给予干预后的EPCs,继续喂养2周后采用血管造影、免疫组织荧光的方法观察EPCs体内血管修复能力。(3) ox-HDL对EPCs功能影响的信号通路研究:干预分组的情况同第二部分,在干预结束后,收集细胞总蛋白和核蛋白,采用Western Blot方法检测MAPK通路(p38、JNK、ERK)相关蛋白的磷酸化水平,采用凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)方法检测NF-κB活性。 研究结果:(1)ox-HDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选:ox-HDL干预EPCs后,与细胞运输、转录调控、信号转导、应激反应、代谢、运动、分化、细胞周期、粘附等相关的基因表达均有变化,其中在与HDL或ox-HDL相关的受体中,ox-HDL干预后CD36表达显著增加,为未干预组2.3751倍,其余受体表达无显著变化。随后的realtime PCR和Western Blot的结果进一步验证了ox-HDL可以呈浓度依赖性促进CD36表达增加(P0.05),而相对应的是HDL并无此作用。(2)ox-HDL对EPCs功能的影响:ox-HDL呈浓度依赖性促进EPCs凋亡,抑制其迁移、体外血管新生以及裸鼠肢体缺血后体内血管新生能力,促进EPCs内ROS水平(P0.05),而对血管新生相关因子的影响主要表现在促进TSP-1表达及分泌(P0.05),但对VEGF表达影响不显著,这些损害作用在预先给予CD36抗体处理后均有部分减轻。(3)ox-HDL对EPCs功能影响的信号通路研究:ox-HDL呈浓度依赖性促进p38 MAPK的磷酸化,而对MAPK通路的其他两方面ERK和JNK的磷酸化则无显著的影响,EMSA结果提示,ox-HDL呈浓度依赖性提高NF-κB的活性,且在预先给予CD36中和抗体处理后,ox-HDL对p38 MAPK和NF-κB的促进作用显著降低。 研究结论:我们的结果揭示了与HDL相反,ox-HDL具有损害EPCs功能的作用,该损害作用通过CD36受体途径介导,与p38 MAPK和NF-κB信号通路密切相关,这可能是缺血性疾病血管新生功能受损的重要机制之一。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R54

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