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《第二军医大学》 2010年
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应用RNA干扰技术沉默Med-19基因及其对大肠癌细胞增殖影响研究

鄂继福  
【摘要】: 近年来,中国大肠癌的发病率以及死亡人数呈不断上升趋势,我国的上海、广东等发达地区,每年大肠癌发病人数根式以4.2%速度在增长,其增幅超过西方发达国家的水平。大肠癌因其早期症状不明显,在已确诊患者中中晚期占大多数,是一种恶性程度较高,对人民威胁程度较大的消化道肿瘤,死亡率位居西方发达国家恶性肿瘤死亡率的第2、3位,在发展中国家发病率也逐年升高。据调查显示,目前大肠癌在中国大部分地区已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一。2002年以后上海市大肠癌发病率已经超越胃癌跃居第2位,仅次于肺癌。当前,目前治疗大肠癌的方法主要是以手术切除为主,辅助以化疗、放疗或免疫治疗,以及中药治疗等。由于大肠癌早期发现率较低,大肠癌术后5年内的复发率、死亡率仍然保存在一个较高的水平。早期发现,有效进疗大肠癌成为的目前医疗及科研工作者的共同目标,如何寻找作为大肠癌早期诊断的新型敏感肿瘤标志物及新的大肠癌治疗靶目标基因,成为目前大肠癌基础及临床研究的热点。本研究关注中介体(Mediator, Med)家族的一个重要成员--Med-19。 RNA干扰技术就是将与内源mRNA编码区同源双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞,通过一系列细胞反应引起特异性地降解对应的mRNA,从而导致特定基因表达沉默的一种技术。该项技术简单、高效已成为研究基因功能的有效工具。而利用慢病毒作为siRNA的装载工具,可以在细胞内长时间、稳定地生成siRNA,保证了基因抑制的效率和试验。本实验中,我们根据其mRNA序列设计Med-19基因RNAi的有效靶序列,构建表达siRNA慢病毒载体,为进一步研究Med-19基因在大肠癌发生发展中的作用并且进一步探讨其探讨其作用机制奠定基础。 中介体(Mediator, Med),是RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的重要组成部分,其在在真核mRNA合成的活化和阻抑中起着关键作用。1990年kelleher等人在研究酵母RNA聚合酶Ⅱ转录功能时发现,并将其分离,通过最近几年的研究Med复合物的亚基组成及其相关的功能活性已经被逐步揭开。Med的功能包括促进激活的转录、增强基础转录、增强CTD的磷酸化。作为Med家族的重要一员,Med-19在细胞生长中起到重要作用,可直接或间接参与、介导多种信号途径。已有研究发现:Med19基因的表达在高侵袭性肺癌细胞的表达要明显高于低侵袭性细胞。 本实验,首先在组织水平上,我们通过Realtime-PCR以及免疫组化的方法比较检测大肠癌及正常大肠肠壁组织中的Med-19mRNA及蛋白质含量,结果发现大肠癌组织中的该基因mRNA的表达量明显高于正常组织。这样为进一步在细胞水平研究该基因奠定了基础。 其次,我们应用大肠癌细胞进行Med-19基因沉默相关功能研究。第一步制备以慢病毒为载体的Med-19-siRNA,根据Med-19基因信息设计Med-19-siRNA序列,成功构建慢Med-19-siRNA病毒载体载体,通过Western Blot筛选有效靶点,寻找效率最高siRNA,通过易转染的293T细胞转染验证其转染能力。成功构建慢病毒载体后,我们选择大肠癌细胞进行试验,试验主要在大肠癌细胞系DLD-1与RKO上进行。首先应用病毒载体对大肠癌细胞进行转染,荧光免疫试验证实慢病毒载体成功感染了大肠癌基因,感染率超过90%。应用实时定量PCR以及Western Blot方法证实转染Med-19-siRNA大肠癌细胞其Med-19mRNA及蛋白的表达相比空白对照组(正常培养的大肠癌细胞)及阴性对照组(转染空白病毒载体大肠癌细胞)有明显减弱,以上研究结果证明我们设计的Med-19-siRNA成功抑制了大肠癌细胞Med-19基因的表达。 进一步我们进行细胞功能学试验,由以下几个实验组成,MTT试验、Brdu试验、流式细胞试验、克隆形成试验。试验分3组进行:空白对照组、阴性对照组以及基因沉默组。阴性对照组转染慢病毒空白载体,基因沉默组转染Med-19-siRNA。结果发现Med-19基因沉默组大肠癌细胞比较其他两组增殖受到明显抑制,DLD-1与RKO细胞处于繁殖期的比例明显低于正常对照组和阴性对照组,细胞形成群落的数量明显少于对照组。 第三部分的裸鼠成瘤试验,我们选择30支雄性裸鼠分基因沉默组、空白对照组、阴性对照组进行,按组别分别接种相同数量Med-19基因沉默的大肠癌细胞、正常培养的大肠癌细胞、感染空载病毒的大肠癌细胞。于种植后15天、20天、25天分别观察肿瘤体积变化,1月后处死裸鼠后比较肿瘤重量。结果显示:基因沉默组的裸鼠肿瘤体生长明显受到抑制,肿瘤生长速度慢于其他两组,肿瘤的平均体积及重量明显小于其他两组。 综上所述:本研究对大肠癌组织Med-19基因表达进行观察,通过成功制备慢病毒为载体的Med-19-siRNA,对大肠癌细胞Med-19基因进行沉默后发现大肠癌细胞的增殖能力受到明显抑制,成瘤能力减弱。并为更加深入地探讨Med-19基因与大肠癌的发生、发展关系以及Med-19基因参与大肠癌发病的机制提供较好的理论依据。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.34

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【引证文献】
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1 王文;Med19在非小细胞肺癌表达的临床意义及与Ki-67的关系[D];济南大学;2012年
【参考文献】
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1 杨怡姝,陈国敏,董温平,陈启民,耿运琪,曾毅;嵌合人牛免疫缺陷病毒cDNA的构建及其在MT_4细胞中的活性分析[J];中华实验和临床病毒学杂志;2003年02期
2 ;Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年09期
3 ;Identification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette[J];World Journal of Gastroenterology;2005年13期
4 ;Effective siRNA targets screening for human telomerase reverse transcriptase[J];World Journal of Gastroenterology;2005年16期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘晓;王洪梅;宋玲玲;武建明;杨宏军;高运东;仲跻峰;何洪彬;;RNAi及其抗口蹄疫病毒研究进展[J];安徽农业科学;2011年04期
2 毛振彪;邵建国;王唯一;谭畅;黄伟达;黄介飞;;靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化[J];第二军医大学学报;2007年08期
3 王峰;陈琳;邵建国;毛振彪;;慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达[J];第二军医大学学报;2008年01期
4 白莉;祝蓉;陈智鸿;白春学;高磊;张新;;靶向EGFR基因的siRNA表达载体构建及其生物学效应的研究[J];第三军医大学学报;2005年23期
5 张海峰;周国雄;;SiRNA技术在胰腺癌研究中的应用[J];交通医学;2007年04期
6 郁兵;淡飞妮;罗雯;;RNAi在抗肿瘤研究中的应用[J];科学技术与工程;2009年20期
7 田明忠;高杰;王东秋;朱长军;;糖核酸内切酶Ⅲ制备的小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗[J];山东大学学报(医学版);2010年07期
8 尹延梅;于红;周岩冰;张文卿;吕锐;;慢病毒介导的RNAi对人胃癌细胞VEGF表达的影响[J];山东医药;2009年21期
9 马宁;高旭;;转基因动物在microRNA研究中的应用[J];生物化学与生物物理进展;2009年09期
10 陈雅晴;彭薇;陆毅祥;奚涛;;应用RNAi技术治疗HBV的研究进展[J];生命科学;2011年04期
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1 苏旸;牛免疫缺陷病毒微管依赖性运输的研究[D];南开大学;2010年
2 祝蓉;采用RNA干扰技术抑制上皮源性肿瘤细胞表皮生长因子受体表达及阻滞肿瘤细胞周期的实验研究[D];复旦大学;2007年
3 李刚;新胰腺癌基因S100P的相关功能研究[D];第二军医大学;2007年
4 翟志芳;HAX-1在系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中的表达及其功能研究[D];第三军医大学;2007年
5 吴福国;表达Cdc42-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对膀胱癌细胞影响的实验研究[D];兰州大学;2007年
6 张丽芳;SMA细胞模型中Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS通路与细胞凋亡关系的研究[D];中南大学;2008年
7 王增光;大鼠UCHL1基因RNAi重组慢病毒的构建、鉴定及功能研究[D];天津医科大学;2008年
8 钱建平;携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体转染几种皮肤结构重要细胞的实验研究[D];中国协和医科大学;2008年
9 喻钧;慢病毒转染TLR_3基因的小分子RNA对人肺腺癌A549细胞增殖及免疫逃逸影响的研究[D];华中科技大学;2009年
10 张树华;抑制糖酵解途径对胰腺癌细胞PANC-1生物学特性的影响及其机制的研究[D];华中科技大学;2009年
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1 田晓平;端粒酶RNA基因突变对Hela细胞生长的作用[D];浙江理工大学;2010年
2 周小虎;RNA干扰对PANC-1胰腺癌细胞hTERT基因表达的影响[D];昆明医学院;2011年
3 张帅;miR-145通过调控OCT4基因抑制肺腺癌干细胞增殖的实验研究[D];南京医科大学;2011年
4 陈光辉;shRNA靶向干扰COX-2抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤及其血管生成[D];重庆医科大学;2011年
5 田明忠;核糖核酸内切酶Ⅲ制备的HBV小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗[D];山东大学;2011年
6 赵延森;黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究[D];华中农业大学;2011年
7 王唯一;人胰腺癌组织APRIL蛋白检测及靶向APRIL基因小干扰RNA制备[D];南通大学;2006年
8 李保顺;hTERT siRNA对肺癌细胞及肺癌移植瘤生长抑制的研究[D];中南大学;2006年
9 刘波;H5N1-NS1基因的融合表达及RNAi技术抑制BmNPV增殖的研究[D];苏州大学;2007年
10 刘丹;RNAi抑制AIV复制及表达抗AIV多靶点miRNA的转基因鼠制备[D];中国农业科学院;2008年
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1 崔斐;陈斌;陈锦章;黄宇贤;罗荣城;;凋亡抑制蛋白Survivin和血管内皮生长因子在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J];南方医科大学学报;2008年05期
2 张殊;林其德;;表观遗传学在卵巢癌研究中的进展和思考[J];国际妇产科学杂志;2009年04期
3 于维霞,熊胜道,卢朝辉,罗玉风,万建伟,曹金伶;Fascin与Ki-67在分化差的非小细胞肺癌中的表达[J];中国实用内科杂志;2005年08期
4 胡春燕;周建华;;DNA甲基化修饰异常与肺癌[J];国际病理科学与临床杂志;2009年05期
5 孔令建;赵晶;曲波;樊微微;高善玲;;Survivin、COX-2及VEGF在大肠癌中的表达及与肿瘤微血管密度的关系[J];世界华人消化杂志;2009年20期
6 陈龙,张宝仁,郝家骅,张荣良,周洪堂;肺鳞癌DNA含量定量分析及其临床意义[J];中华胸心血管外科杂志;1994年02期
7 丁相福;李俊安;宋彬;房学东;;Med19基因沉默对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响[J];中国老年学杂志;2010年08期
8 丁相福;黄国民;李俊安;房学东;;Med19在人胃癌中的表达及其临床意义[J];中国老年学杂志;2010年09期
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1 田庆;一个新的肺癌转移相关基因—LCMR1的克隆,序列分析,表达谱研究及其生物学功能的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
2 张郁;LCMR1反义寡核苷酸对高转移肺大细胞癌细胞系-95D细胞生物学行为的影响及LCMR1基因功能的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
3 马秀清;LCMR1蛋白在非小细胞肺癌的表达及其临床意义探讨[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年
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1 赵西平,王宝菊,杨燕,杨东亮,郝连杰;慢性肝病患者肝组织中HGV抗原的表达及意义[J];中华肝脏病杂志;1998年02期
2 齐艳华,王康孙,洪杉;PRK术后角膜基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达[J];眼科;2000年01期
3 毛宁,洪智勇,张岩芳,黄谚谚,吴松刚;利用啤酒酵母提取RNA的氨法工艺研究Ⅱ[J];药物生物技术;2000年01期
4 付汉江,郑晓飞;类mRNA RNA研究进展[J];国外医学.分子生物学分册;2002年04期
5 胡成进,杨道理,舒冠双;一种快速提取真核细胞总RNA的方法[J];陕西医学检验;1997年02期
6 刘定干;同时抽提DNA和RNA的简便方法[J];生命的化学;1998年02期
7 刘栋,刘志红;流式细胞仪检测细胞体积及RNA/DNA比值[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1999年03期
8 田芙蓉,曾桂英,谷小刚;IL-1β加酵母RNA对照射小鼠外周血肝脾GSH与SOD活性的影响[J];第四军医大学学报;2001年01期
9 朱迅,杨贵贞;同一细胞DNA和RNA同时分别提取的简便方法[J];吉林大学学报(医学版);1991年01期
10 罗元辉,王东旭;RT-PCR技术检测外周血/骨髓中肿瘤细胞[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1997年01期
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1 岳洋;朱化彬;郝海生;杜卫华;赵学明;王栋;;牛精子总RNA制备及mRNA线性扩增的初步研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
2 李士泽;赵雅楠;李玉恒;杨焕民;;冷诱导RNA结合蛋白的结构与功能[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
3 王洁;刘金亮;阴筱;高瑞;李向东;刘焕庭;;HC-Pro三个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 康磊;王荣福;闫平;;放射性标记对小干扰RNA在体内分布的无创性示踪研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
5 王峰;张秋平;陈金湘;;棉花总RNA的快速提取方法[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年
6 赵庆华;田纪伟;王雷;董双海;王震;刘诚袆;;RNA干扰环氧化酶2对人腰椎退变终板软骨细胞生长增殖及凋亡的影响[A];第十九届中国康协肢残康复学术年会论文选集[C];2010年
7 孙凯;汪谦;;液相芯片技术在小分子RNA检测分析中的应用[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年
8 张晖;覃君慧;柳金雄;冯亚玫;陈秋生;;Sox2 RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚中的原位杂交检测[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
9 孔瑞瑞;;hALP,一个新的t-UTP,通过结合并乙酰化UBF促进RNA Pol I的转录[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
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1 记者 常丽君;新技术让研究进入单细胞内RNA的世界[N];科技日报;2011年
2 聂翠蓉;RNA:纵是配角也精彩[N];科技日报;2009年
3 伊瑶;RNA干扰技术成明日黄花?[N];医药经济报;2011年
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5 本报记者 衣晓峰 聂松义 通讯员 陈英云;微小RNA揭开心律失常之谜的“金钥匙”[N];健康报;2010年
6 冯卫东;RNA干扰机制首次在人体中获得证实[N];科技日报;2010年
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9 记者 刘海英;病毒会利用微RNA对人体实施攻击[N];科技日报;2010年
10 陈蕾;赛默飞世尔启动RNA干扰研究/药物筛选资助项目[N];中国包装报;2009年
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2 于丽;纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因治疗大肠癌的实验研究[D];中南大学;2009年
3 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
4 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
5 金哲秀;RNA干扰抑制基质金属蛋白酶对小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究[D];吉林大学;2011年
6 李建华;髓样细胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究[D];复旦大学;2010年
7 孙永刚;核干细胞因子RNA干扰对HT29细胞CDX2表达的影响[D];第三军医大学;2009年
8 刘爱军;脑内冷诱导RNA结合蛋白的表达及其神经保护作用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
9 靳宇;RNA带扭结结构的组合研究[D];南开大学;2010年
10 张璟;RNA干扰对XWLC-05肺癌细胞水通道蛋白3表达的影响[D];昆明医学院;2011年
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1 李喜英;黄瓜花叶病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究[D];浙江理工大学;2010年
2 王冕;棉花RNA依赖的RNA聚合酶6(GhRDR6)基因的分离及功能分析[D];山东农业大学;2011年
3 王庆晓;RNA干扰逆转HeLaB2/DDP细胞顺铂耐药的研究[D];南京大学;2011年
4 石杜娟;利用RNA干扰技术抑制日本血吸虫酪氨酸羟化酶的合成[D];安徽医科大学;2011年
5 张旭;表达猪let-7c细胞株的建立及其对猪瘟病毒的调控作用[D];西北农林科技大学;2010年
6 王少军;RNA解旋酶p68在创伤愈合中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2010年
7 丁艳杰;葡萄病毒A MP基因RNA干扰载体的构建及其鉴定[D];中国农业科学院;2011年
8 孔帅;RNA干扰技术沉默MDR1基因逆转大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu的耐药性[D];山东大学;2010年
9 崔广迪;基于H1N1的RNA二级结构的相似性比较研究[D];吉林大学;2010年
10 孟益聪;哺乳动物细胞有丝分裂中期染色体上RNA成分的研究[D];兰州大学;2010年
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