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《第二军医大学》 2010年
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DLC-1在垂体腺瘤中的表达与侵袭性的关系及其启动子甲基化的实验研究

张风林  
【摘要】: 垂体腺瘤约占颅内肿瘤的10%~15%,尽管它是良性肿瘤,但是仍然可以导致临床症状。占位效应可以导致头痛、视力下降;功能性垂体腺瘤可以引起激素分泌失调,能导致情绪障碍、性功能障碍、不育、肥胖、高血压、糖尿病,加速心脏疾病恶化;残余的正常垂体组织受压会出现垂体功能低下。垂体腺瘤的发生发展涉及诸多因素:基因突变与失活、下丘脑激素、生长因子、细胞因子等。垂体腺瘤中可见基因突变、缺失、重组,而异常甲基化致肿瘤抑制基因沉默也是垂体腺瘤发生的一个重要机制。越来越多的证据表明垂体腺瘤是单克隆发生并且伴随基因改变,然而我们对于垂体瘤发生发展伴随的基因改变仍然所知甚少。 为了研究垂体瘤发生发展机制,本课题组前期使用Affymetrix公司U133 Plus2.0基因芯片研究人侵袭性、非侵袭性垂体瘤和人正常垂体之间的基因表达差异,发现一系列下调基因,其中包括DLC-1。1998年,Yuan等在对多个肝癌细胞系的8号染色体的研究中,用再现差异分析法(RDA),发现一种重要抑癌基因DLC-1。现已发现在许多原发肿瘤和细胞系中DLC-1均出现低表达或表达缺失,但在人体各正常组织中均表达;在多种原发肿瘤和细胞系中还发现了DLC-1基因发生启动子甲基化。DLC-1含有三个结构域:RhoGAP、SAM和START。研究表明DLC-1能调节细胞骨架形成和形态改变,影响细胞转录、增殖、迁移和凋亡。 为探讨DLC-1基因在垂体腺瘤发生发展中的作用,本课题探讨了垂体腺瘤中DLC-1不同转录本mRNA的表达、蛋白表达与垂体腺瘤侵袭性的关系,并对DLC-1启动子甲基化进行了研究;初步探讨DLC-1基因在垂体腺瘤的发生发展过程中发挥的作用。本论文从以下三个方面进行了研究:1.人垂体腺瘤中DLC-1不同转录本mRNA的表达和垂体腺瘤侵袭性关系的实验研究;2.人垂体腺瘤中DLC-1的蛋白表达和垂体腺瘤临床病理相关性分析的实验研究;3.人垂体腺瘤中DLC-1启动子甲基化状态的研究。 第一部分人垂体腺瘤中DLC-1不同转录本mRNA的表达和垂体腺瘤侵袭性关系的实验研究 目的:明确DLC-1三个不同转录本mRNA在正常垂体和各类型垂体腺瘤组织中的表达情况及其同垂体腺瘤侵袭性的关系。 方法:设计各转录本特异性引物,运用荧光定量聚合酶链反应技术,检测DLC-1不同转录本mRNA在正常垂体和各类型垂体腺瘤组织中的表达。垂体腺瘤标本按临床表现和磁共振特征分为侵袭组和非侵袭组,按临床表现和免疫组化分为功能性腺瘤组和无功能腺瘤组。分析不同转录本在各组表现情况。 结果:1.DLC-1转录本一、二在正常垂体及垂体腺瘤中均有表达:未见有第三转录本表达。2.正常垂体中DLC-1转录本一、二的mRNA表达水平显著高于垂体腺瘤组(P0.01);侵袭组中DLC-1转录本一、二的mRNA表达水平显著低于非侵袭组(P0.01),功能性腺瘤组与无功能腺瘤组表达量无显著差异(P0.05); 结论:DLC-1转录本一、二在正常垂体及垂体腺瘤中均有表达,与垂体腺瘤侵袭性关系密切:未见有第三转录本表达。 第二部分人垂体腺瘤中DLC-1的蛋白表达和垂体腺瘤临床病理相关性分析的实验研究 目的:明确DLC-1、Ki-67蛋白在各类型垂体腺瘤组织及正常垂体中的表达及其同垂体腺瘤临床病理的关系,探讨DLC-1和Ki-67的相关性。 方法:垂体腺瘤标本按临床表现和磁共振特征分为侵袭组和非侵袭组,按临床和免疫组化分为功能性腺瘤组和无功能腺瘤组。运用免疫组化技术观察DLC-1和Ki-67蛋白的细胞表达定位,以及在不同组别的表达差异,讨论二者表达的相关性;运用western-blot方法检测标本中DLC-1的蛋白表达,观察其与垂体腺瘤侵袭性关系。 结果:1.DLC-1蛋白表达定位于垂体腺瘤及正常垂体细胞浆:Ki-67蛋白主要表达于细胞核。2.正常垂体中DLC-1蛋白表达水平显著高于垂体腺瘤组(P0.01);侵袭组中DLC-1蛋白表达水平显著低于非侵袭组(P0.01),功能性腺瘤组和无功能腺瘤组无明显差异(P0.05):3.垂体腺瘤中Ki-67蛋白表达水平显著高于正常垂体组(P0.01);侵袭组Ki-67蛋白表达水平显著高于非侵袭组(P0.01),功能性腺瘤组和无功能腺瘤组无显著差异(P0.05);4.垂体腺瘤中DLC-1和Ki-67的蛋白表达有负相关性(r=-0.764,P0.01)。 结论:DLC-1表达下调可能和垂体腺瘤的发生、侵袭性及增殖能力改变有关; 第三部分人垂体腺瘤中DLC-1启动子甲基化状态的研究 目的:明确人垂体腺瘤中DLC-1低表达是否由于基因启动子甲基化引起。 方法:设计DLC-1基因甲基化、非甲基化引物,运用MSP(methylation-specificPCR,甲基化特异性PCR)方法检测人垂体腺瘤细胞中DLC-1启动子甲基化状态。 结果:所有垂体腺瘤标本非甲基化引物都能扩增,而仅有2例(2/15)标本甲基化引物能扩增;甲基化、非甲基化引物扩增产物的克隆测序结果进一步验证MSP的检测结果是特异的。 结论:DLC-1基因启动子甲基化可能不是垂体腺瘤细胞中DLC-1低表达的主要原因,可能存在其它原因。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R736.4

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【参考文献】
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【共引文献】
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