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《第二军医大学》 2010年
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硒化镉量子点对人皮肤细胞的毒性效应研究

宋方茗  
【摘要】:近年来,半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视,其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科,已成为一门新兴的交叉学科。目前研究较多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。半导体纳米微晶体(又称量子点)由于其特有的物理和化学性质,如激发光谱宽、发射光谱窄,而且可通过改变量子点内核心材料的尺寸大小对其发射光波长进行调频等,它开始被作为一种新型的荧光标记物在生物医学中获得广泛使用。随着量子点的应用,人体暴露机会日益增加,其安全性问题也日益受到关注。 本论文从人黑色素瘤细胞(A375,A375.s2)以及正常人表皮细胞(HaCaT)的基本培养入手,对于细胞培养过程中需要的传代、冻存、复苏等基础而必需的实验环节进行了摸索和完善;通过CCK-8试剂盒,绘制出了三种细胞系的增殖曲线,以及三种细胞系的生长曲线,并观察了处于对数生长期细胞的形态;同时以量子点(QDs-545和QDs605)为研究对象,以人黑色素瘤细胞(A375,A375.s2)为模型,人正常表皮细胞HaCaT为阴性模型,首先采用CCK-8法检测两种不同粒径量子点QDs-605,QDs-545分别对A375,A375.s2,HaCaT细胞增殖的影响;其次采用荧光显微镜观察两种不同粒径量子点QDs-605,QDs-545分别对A375,A375.s2,HaCaT细胞形态的影响,以及三种细胞系分别与两种不同粒径量子点QDs-605,QDs-545非特异性结合;然后根据荧光显微镜与CCK-8法所得结果,分别筛选低剂量量子点QDs-605,QDs-545浓度,通过流式细胞仪检测A375,A375.s2,HaCaT细胞与量子点QDs-605,QDs-545的非特异性作用;然后利用PI单染法流式细胞术检测低剂量量子点QDs-545导致A375,A375.s2,HaCaT细胞凋亡;最后利用水飞蓟宾能够有效调节氧化带来的损伤,考查了其对量子点在细胞中毒性的干预作用。论文初步探讨了不同粒径CdSe/ZnS量子点QDs-605和QDs-545的细胞毒性及相关的毒性机制,并且首次考查药物调节量子点对细胞的氧化损伤,为CdSe/ZnS量子点的安全性提供一定的实验依据。实验结果表明: 1、CCK-8法检测CdSe/ZnS QDs-545和CdSe/ZnS QDs-605对A375,A375.s2,HaCaT细胞的毒性 随着QDs-605浓度的增加,A375,A375.s2细胞存活率随之下降。不同浓度的QDs-605作用于A375,A375.s2细胞,24h后其细胞存活率均低于空白组,并具有显著性差异(P0.05或P0.001),而不同浓度的QDs-605作用于HaCaT细胞24h,只有QDs-605浓度为162,81,2.025,1.0125nmol/L时与空白组比较有显著性差异,其它浓度与空白组无显著性差异。并且在高剂量162nmol/L QDs-605作用A375,A375.s2,HaCaT细胞24 h时,A375,A375.s2细胞存活率分别为7.3%,10.3%,接近90%的细胞死亡,而HaCaT细胞存活率为50%。 不同浓度的QDs-545作用于A375,A375.s2细胞,24h后其细胞存活率均低于空白组,并具有显著性差异(P0.05或P0.001),而不同浓度的QDs-545作用HaCaT细胞24h,只有QDs-545浓度为162,54nmol/L与空白组比较有显著性差异,而其它浓度与空白组均无显著性差异。并且在高剂量162nmol/L QDs-545作用A375,A375.s2,HaCaT细胞24 h时,A375,A375.s2细胞存活率分别为24%,16%,接近80%的细胞死亡,而HaCaT细胞存活率为89.7%。这说明两种不同粒径量子点QDs-605,QDs-545可抑制A375,A375.s2细胞的增殖,但是对HaCaT细胞的增殖没有明显影响。 2、荧光显微镜观察CdSe/ZnS QDs-545和CdSe/ZnS QDs-605对A375,A375.s2,HaCaT细胞的影响 随着不同浓度CdSe/ZnS QDs-545和CdSe/ZnS QDs-605分别在人黑色素瘤细胞A375,A375.s2,以及人正常表皮细胞HaCaT孵育24h后,A375,A375.s2细胞均随着量子点(QDs-545和QDs-605)剂量的增加,荧光强度逐渐增强,发生明显非特异性结合,同时A375,A375.s2细胞形态也相应发生明显变化,并且在81nmol/L~162nmol/L剂量作用A375,A375.s2细胞24h后,A375,A375.s2细胞呈现大面积凋亡。而人正常表皮细胞HaCaT在高剂量540~171 nmol/L形态没有发生变化,并且在量子点浓度为27 nmol/L ~162nmol/L剂量作用24h后,没有明显的非特异性结合。这说明两种不同粒径量子点QDs-605,QDs-545对A375,A375.s2细胞有明显毒性,对HaCaT细胞没有明显毒性;并且QDs-605,QDs-545对A375,A375.s2细胞的毒性与非特异性结合有密切联系。 3、PI单染法检测CdSe/ZnS QDs-545对A375,A375.s2,HaCaT细胞凋亡的影响 通过MTT法以及荧光显微镜观察所得结果:中高剂量量子点QDs-605,QDs-545对A375,A375.s2有明显毒性,因此利用流式细胞仪的灵敏度高的优点,选择中低剂量QDs-545对A375,A375.s2,HaCaT三种细胞的毒性作用,检测是否出现细胞凋亡。结果表明:QDs-545孵育A375,A375.s2细胞24h后,PI单染孵育后的A375,A375.s2细胞,结果出现明显的凋亡峰迁徙,说明中低剂量QDs-545能够引起人黑色素瘤细胞明显凋亡,而经QDs-545孵育人正常表皮细胞HaCaT,结果没有出现凋亡峰的迁移。这说明中低剂量量子点对人黑色素瘤细胞A375,A375.s2也有一定的毒性作用,但是对人正常表皮细胞HaCaT没有影响。 4、A375,A375.s2,HaCaT细胞与CdSe/ZnS QDs-545和CdSe/ZnS QDs-605非特异性结合 通过PI单染法得出结果:中低剂量也能引起人黑色素瘤细胞(A375,A375.s2)细胞凋亡,因此通过流式细胞仪检测人黑色素瘤细胞(A375,A375.s2)细胞分别与中低剂量量子点(QDs-605,QDs-545)非特异性结合,实验说明:非特异性结合即主要通过细胞吞噬,随着QDs-605,QDs-545浓度的增加,A375,A375.s2与QDs-605,QDs-545非特异性结合越强,并且发现相比正常表皮细胞,肿瘤细胞更容易吞噬外来物质。 5、药物对硒化镉量子点在A375,A375.s2细胞毒性的干预作用 通过MTT法观察细胞活性,结果发现:不加水飞蓟宾干预,随着QDs-605浓度的增加,A375,A375.s2细胞存活率随之下降。若分别加入20mg/mL与10mg/mL SM在A375,A375.s2细胞中孵育2h后,随着QDs-605浓度的增加,A375,A375.s2细胞的存活率明显升高,与不加SM干预,单纯QDs-605孵育后的细胞存活率相比,有显著性差异(p0.05)
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