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《第三军医大学》 2011年
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纤维粘连蛋白EDA片段调控结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和糖酵解及其机制研究

耿培亮  
【摘要】:背景与目的 结直肠癌是常见的恶性肿瘤,其发病率占胃肠道肿瘤的第3位。尽管肿瘤的早期诊断和临床治疗取得了很大进步,但是每年全世界仍有超过50 000结肠癌患者死亡,占全部肿瘤死亡人数的10%。在我国,随着饮食习惯的改变,其发病率逐年上升,死亡率居各种恶性肿瘤的第四位。结直肠癌的治疗是以手术为主,辅以化疗、放疗的综合治疗。结直肠癌的手术切除率可达到60% ~70%,然而术后5年生存率仍然徘徊在50% ~60%左右,扩大手术范围则无法提高患者的受益率。因此,以化学治疗、放射治疗等为主的术后辅助治疗,成为提高结肠癌生存率的重要手段。目前分子靶向治疗是肿瘤治疗领域的一个重大突破,如西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)和帕尼单抗(Panitumumab)等分子靶向药物在结肠癌的治疗中获得了良好的临床治疗效果。因此,深入研究结肠癌发生、发展的分子机制,将有助于寻找新的结肠癌治疗靶点。 肿瘤间质成分及其分泌的生长因子等构成的肿瘤微环境在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。近年的研究表明,肿瘤微环境与恶性肿瘤的能量代谢密切相关。纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是一种细胞外基质蛋白,其中EDA为其基因在转录为前体mRNA后的剪切区。纤维粘连蛋白EDA片段(Fibronectin-EDA,EDA- FN)在肿瘤组织中呈现特异性高表达,在细胞粘附、迁移及肿瘤的浸润和转移中发挥重要作用。 以有氧代谢为主的葡萄糖代谢是细胞主要的能量获取方式。然而,肿瘤细胞似乎更偏爱糖酵解供能。与正常组织或者良性组织相比,肿瘤细胞的糖酵解明显升高。即使在有氧条件下肿瘤细胞仍主要利用糖酵解供能,这种现象称为瓦博格效应(Warburg effect),这一现象为设计各种抗肿瘤糖代谢的药物提供了理论基础。 葡萄糖跨膜进入细胞后被磷酸化为6-磷酸葡萄糖,从而开始糖酵解。糖酵解不仅提供肿瘤能量代谢所需的ATP,而且提供核苷酸、蛋白和脂类等生物大分子合成的前体和还原当量。人体中葡萄糖的跨膜转运主要依赖两大类葡萄糖转运蛋白,一类为钠依赖性葡萄糖转运蛋白(Sglt),另一类为易化性葡萄糖转运蛋白(Glut)。Sglt以主动方式逆浓度梯度转运葡萄糖,而Glut则以易化扩散方式顺浓度梯度转运葡萄糖。Glut-1是葡萄糖转运蛋白中最“活跃”的一个,几乎表达于所有肿瘤细胞。既往研究显示,Glut-1的高表达与恶性肿瘤的发生和进展密切相关。恶性肿瘤细胞通过调控Glut-1加速糖酵解,为肿瘤细胞提供更多能量。 我们前期的研究显示,EDA- FN在八种结肠癌细胞中的表达差异明显,其中在SW480细胞中表达明显增高。而目前针对结肠癌中EDA- FN调控Glut-1的研究仍无相关报道。因此,我们将在前期工作的基础上,探讨EDA- FN是否可通过调节Glut-1的表达影响结肠癌糖代谢,以期为针对结肠癌糖代谢的的靶向治疗提供理论依据。 方法 1、检测EDA-FN的表达、Glut-1的表达及其与结肠癌临床病理特征的关系。 2、构建纤维粘连蛋白EDA片段RNAi慢病毒载体,干扰结肠癌SW480细胞中EDA-FN的表达。 3、干扰EDA-FN的表达后,MTT法检测细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测SW480细胞转染前后Bax和Bcl-2的变化。 4、干扰EDA-FN的表达后,高效液相色谱检测AMP、ADP、ATP的变化;Western blot检测SW480细胞转染前后Glut-1蛋白及其信号通路的变化。 5、建立裸鼠皮下移植瘤模型进行体内试验。 结果 1、结肠癌组织中EDA-FN和Glut-1的阳性表达率均高于对照组(P0.05);两者的表达和淋巴结转移、远处转移和癌组织分化程度有关(P0.05),而与患者的性别、年龄和肿瘤的大小无明显关系;结肠癌组织中两者的表达呈正相关(P0.05)。 2、成功构建EDA基因RNAi干扰慢病毒载体和空载体,并转染入SW480细胞,采用流式细胞技术进行细胞分选,GFP阳性率70%。 3、MMT检测显示转染组与未转染组、空载体组相比,结肠癌SW480细胞的生长明显受到抑制,差异具有统计学意义(P0.05);流式细胞术显示SW480细胞的EDA-FN被干扰后细胞的早期凋亡由5.07±0.23增加到28.82±2.12(P0.05);晚期凋亡由3.09±1.13增加到47.76±1.51(P0.05)。转染空载体时,对SW480细胞的凋亡无明显影响。 4、高效液相色谱显示干扰EDA-FN后ADP、ATP的含量降低,表明EDA-FN被干扰后肿瘤细胞的糖酵解能力降低,从而可能导致干扰后的结肠癌细胞对葡萄糖的摄取和利用减少;Western blot显示Glut-1蛋白在各组SW480细胞中均有表达,但在转染组细胞中Glut-1蛋白被明显抑制。 5、480细胞的EDA-FN被干扰后的裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力被明显抑制;激光共聚焦显微镜观察冰冻切片的免疫荧光显示结肠癌SW480细胞EDA-FN被干扰后的裸鼠皮下移植瘤中Glut-1的表达位置的变化不明显,没有由胞浆向胞膜移位的现象;而Glut-1的蛋白表达量明显减少。 结论 1、结肠癌组织中EDA-FN和Glut-1的阳性表达率均高于对照组;结肠癌组织中两者的表达呈正相关;EDA-FN和Glut-1的过表达可能在结肠癌的发生、发展中发挥重要作用。 2、干扰EDA-FN后结肠癌SW480细胞的细胞存活率明显降低,同时凋亡明显增加,提示EDA-FN对结肠癌SW480细胞具有促增殖、抗凋亡的能力。 3、EDA-FN可能通过增加结肠癌细胞中Glut-1的表达,继而增强结肠癌细胞的糖酵解能力,从而导致结肠癌细胞对葡萄糖的摄取和利用增加。 4、结肠癌SW480细胞的EDA-FN被干扰后的裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力被明显抑制。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.3

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